自噬在纳米氧化锌诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-04 04:27

【摘要】：目的:纳米氧化锌(Zinc oxide nanoparticles,ZnO NPs)在工业中广泛应用,其除对肝脏和神经有毒性之外,还对雄性生殖系统有毒性,但其确切机制仍不甚清楚。本课题主要通过观察ZnO NPs对活体雄性小鼠睾丸组织和小鼠睾丸间质细胞的影响,探究自噬在ZnO NPs诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用及调节机制。方法:用HE染色检测ZnO NPs对小鼠睾丸及附睾的病理损伤,用Western blot检测ZnO NPs对小鼠睾丸组织的凋亡和自噬的影响,活性氧检测试剂盒检测ZnO NPs对小鼠睾丸组织和小鼠睾丸间质TM3细胞氧化应激的影响。用ELISA法检测ZnO NPs对小鼠血清睾酮含量的影响。用MTT法检测ZnO NPs和H2O2对小鼠睾丸间质TM3细胞活性的影响;分别用Western blot和Annexin V-FITC/PI双染色法检测ZnO NPs对TM3细胞凋亡的影响;分别用Western blot和电镜检测ZnO NPs和H2O2对TM3细胞自噬的影响。结果:用不同浓度的ZnO NPs(0,100,200,400 mg/kg/d)连续给小鼠灌胃28天后,与对照组相比,ZnO NPs对小鼠睾丸及附睾系数无明显影响(P0.05)。HE染色结果显示,对照组小鼠睾丸生精细胞排列整齐、紧致;与对照组相比,100 mg/kg ZnO NPs处理组的小鼠睾丸生精细胞排列也比较整齐,并无明显的生精细胞脱落;200及400 mg/kg ZnO NPs处理组的小鼠睾丸生精细胞排列明显紊乱、松散,并出现不同程度的脱落。ZnO NPs还显著降低小鼠附睾中的精子数量。Western blot结果显示,ZnO NPs可增加小鼠睾丸组织内cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、Bax蛋白含量并抑制Bcl-2蛋白的表达,提示ZnO NPs可诱导小鼠睾丸组织凋亡。ZnO NPs还可使小鼠睾丸组织内自噬标志蛋白LC3-II含量、LC3-II/LC3-I的比例以及自噬相关蛋白Atg-5和Beclin-1的表达显著增加,提示ZnO NPs可诱导小鼠睾丸组织自噬。与对照组相比,ZnO NPs处理组小鼠睾丸组织中的MDA和GSH含量分别增加和降低;ZnO NPs还呈浓度依赖式地抑制小鼠睾丸组织内SOD和GSH-PX的活性,提示ZnO NPs可诱导小鼠睾丸组织产生氧化应激。ELISA结果显示,ZnO NPs可显著降低小鼠血清中睾酮含量(P0.05),提示ZnO NPs可能影响睾丸间质细胞的功能。体外实验表明,ZnO NPs呈浓度依赖式地抑制小鼠睾丸间质TM3细胞活性(P0.05),并显著增加TM3细胞内cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和Bax蛋白含量和抑制细胞内Bcl-2蛋白的表达,提示ZnO NPs可诱导TM3细胞凋亡。Annexin V-FITC和PI双染色法进一步证实ZnO NPs可诱导TM3细胞凋亡。ZnO NPs可诱导小鼠睾丸间质细胞产生氧化应激(P0.05);H2O2在显著抑制TM3细胞活性的同时(P0.05),还可诱导TM3细胞凋亡,而在用N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)抑制细胞氧化应激后,ZnO NPs对细胞活性的抑制和凋亡的诱导作用均明显减弱。以上结果显示,氧化应激参与了ZnO NPs对TM3细胞凋亡的诱导。Western blot结果显示,ZnO NPs和H2O2可诱导小鼠睾丸间质TM3细胞自噬,用NAC抑制细胞内氧化应激后,ZnO NPs对TM3细胞自噬的诱导明显降低,提示氧化应激还参与了ZnO NPs对小鼠睾丸间质TM3细胞自噬的诱导。在用自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制细胞自噬后,ZnO NPs对TM3细胞活性的抑制和细胞凋亡的诱导更明显。结论:氧化应激参与了ZnO NPs对小鼠睾丸组织和小鼠睾丸间质TM3细胞的凋亡和自噬;自噬抑制可显著增加ZnO NPs对TM3细胞的凋亡。
【图文】：

ZnONPs的特征

附睾,生精细胞,处理组,紧致

图 2. ZnO NPs 对小鼠睾丸及附睾系数的影响Fig.2. Effect of ZnO NPs on testis and epididymal coefficient in male mice. Testis andepididymis were obtained from the male mice treated with 0-400 mg ZnO NPs/kg/day for 28 days.The experiment was done in triplicate and repeated three times. Data were analyzed by one-wayANOVA.3.3. ZnO NPs 对小鼠睾丸毒性的影响给小鼠分别用 0, 100, 200, 400 mg/kg 的 ZnO NPs 连续染毒 28 d 后，用苏木素-伊红（HE）染色法观察 ZnO NPs 对小鼠睾丸及附睾组织形态的影响。结果发现，对照组小鼠睾丸生精细胞排列整齐、紧致；与对照组相比，100 mg/kg ZnO NPs处理组的小鼠睾丸生精细胞排列也比较整齐，并无明显的生精细胞脱落；200 及400 mg/kg ZnO NPs 处理组的小鼠睾丸生精细胞排列明显紊乱、松散，并出现不同程度的脱落（图 3）。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】