委陵菜积雪草酸对非酒精性脂肪肝细胞脂质代谢的影响及作用机制研究

发布时间：2020-06-04 04:17

【摘要】：目的:本文采用油酸(oleic acid,OA)诱导的LO2细胞和HepG2细胞制备非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞模型,通过检测委陵菜积雪草酸对非酒精性脂肪肝细胞中脂质沉积、氧化应激、炎症反应以及对脂肪生成信号通路AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS表达的影响,以此探讨委陵菜积雪草酸(asiatic acid from potentilla chinensis,AAPC)对非酒精性脂肪肝细胞脂质代谢的影响及作用机制。方法:1.非酒精性脂肪肝细胞模型的建立以人肝细胞LO2细胞和HepG2细胞为研究对象,给予不同浓度的OA培养24 h,MTT法测定细胞活性,结合油红O染色、细胞内甘油三酯(TG)及细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)的测定,筛选制备NAFLD细胞模型的最佳OA浓度。2.AAPC对NAFLD细胞脂质代谢的影响MTT法检测AAPC对LO2和HepG2细胞的半数抑制率(IC_(50))。0.5mmol/L OA与不同浓度AAPC作用于细胞后,MTT法观察细胞的增殖;随后将细胞分为5组:正常对照组,模型组,AAPC低、中、高剂量组。AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测AAPC对细胞凋亡的影响;油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况;试剂盒检测细胞TG、游离脂肪酸(FFAs)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、LDH的含量;试剂盒检测各组细胞氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力;RT-PCR法检测SREBP-1c、FAS、LXRα、TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平;免疫组化法检测SREBP-1c蛋白的表达;免疫荧光检测FAS、ACC1蛋白的表达;Western blot法检测SREBP-1c、FAS、LXRα、AMPK、p-AMPK、ACC1、BAX、BCL2、NF-κBp65蛋白的表达。结果:1.非酒精性脂肪肝细胞模型的建立MTT结果显示,OA对LO2和HepG2细胞增殖有抑制作用,且呈浓度依赖性(P0.01)。0.5 mmol/L OA刺激细胞后,油红O染色结果显示模型组细胞内红色脂滴明显增多,此外,模型组细胞内TG、LDH含量较正常对照组显著升高(P0.05或P0.01),呈浓度依赖性,表明0.5 mmol/L是OA制备NAFLD细胞模型的较适宜浓度。2.AAPC对NAFLD细胞脂质代谢的影响(1)AAPC对细胞增殖的影响MTT结果显示,AAPC对LO2和HepG2细胞增殖有抑制作用,且呈浓度依赖性(P0.01),IC_(50)分别为98.182、71.070μmol/L。同时,AAPC对脂肪变性细胞有抑制作用,呈浓度依赖性(P0.01)。与正常组比较,模型组、AAPC低、中、低剂量组细胞调亡率、细胞形态学无明显改变。(2)AAPC对脂肪变性细胞脂质沉积的影响油红O染色结果显示:模型组细胞内见大量红色脂滴,而AAPC低、中、高剂量组脂滴数量都有所下降。此外,与正常对照组比较,模型组细胞内TG、FFAs、LDL含量水平显著升高(P0.01),细胞内HDL含量明显下降(P0.01),经低、中、高剂量AAPC预处理细胞24 h后,再以OA诱导造模,细胞内TG、FFAs、LDL含量明显降低(P0.05或P0.01),而细胞内HDL含量明显上升(P0.05或P0.01)。结果提示,AAPC能明显降低脂质沉积,可能是其抑制非酒精性脂肪肝的重要机制之一。(3)AAPC对脂肪变性细胞肝损伤相关酶的影响与正常对照组比较,模型组细胞培养上清液中ALT、AST、LDH的水平显著升高(P0.01),经低、中、高剂量AAPC预处理细胞24 h后,再以OA诱导造模,细胞上清液中AST、ALT、LDH含量明显降低(P0.01),结果提示,AAPC能降低脂肪变性细胞内酶的含量,从而减轻肝细胞损伤程度。(4)AAPC对脂肪变性细胞氧化应激的影响与正常对照组比较,模型组细胞内MDA含量显著升高(P0.01),细SOD活力明显下降(P0.01),经低、中、高剂量AAPC预处理细胞24 h后,再以OA诱导造模,细胞内MDA含量显著降低(P0.01),SOD活力明显上升(P0.01)。RT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组中TNF-α和IL-6 mRNA的表达显著增多(P0.05或P0.01),AAPC能显著下调肝脂肪变性细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达(P0.05或P0.01)。Western Blot结果显示,与正常对照组相比,模型组中NF-κBp65的表达显著增加(P0.01),AAPC能显著降低脂肪变性细胞NF-κBp65的表达(P0.01)。结果提示,AAPC可能通过抑制NF-κB信号通路继而减轻氧化应激和炎症反应的发生,从而改善脂质代谢过程。(5)AAPC对脂肪变性细胞AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS信号通路的影响PT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组中SREBP-1c、FAS、LXRαmRNA表达显著增多(P0.05或P0.01);AAPC能显著下调肝脂肪变性细胞SREBP-1c、FAS、LXRαmRNA的表达(P0.05或P0.01)。免疫组化结果显示,模型组细胞内SREBP-1c阳性染色细胞增多浓染,在AAPC低、中、高剂量组中可见阳性表达颗粒明显减少及棕色变浅。Western Blot和免疫荧光染色结果显示,与正常对照组相比,模型组中SREBP-1c、FAS、LXRα、ACC1的表达显著增加(P0.01),AMPK和p-AMPK的表达显著减少(P0.01),BAX和BCL2的表达无明显变化,AAPC能显著降低脂肪变性细胞SREBP-1c、FAS、LXRα、ACC1的表达(P0.05或P0.01),升高AMPK和p-AMPK的表达(P0.05或P0.01)对BAX和BCL2的表达无明显变化。结果提示,AAPC对AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS信号通路具有明显的抑制作用,这可能是其改善非酒精性脂肪肝脂质代谢紊乱的重要分子机制之一。结论:委陵菜积雪草酸通过降低脂质沉积来改善油酸诱导非酒精性脂肪肝细胞脂质代谢的作用,其机制可能与减轻氧化应激、炎症反应及抑制AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS信号通路有关。
【图文】：

脂滴,形成情况,油酸,细胞内

Table 1-2 The effects of OA on proliferation in HepG2 cells（ x s，n=6 ）组别浓度（mmol/L）抑制率（%）正常对照组 - -OA 0.125 3.123 0.578OA 0.25 3.370 2.506OA 0.5 4.360 3.050*OA 1 85.296 2.590**注：与正常对照组比较，*P<0.05，，**P<0.013.2 不同浓度 OA 作用下细胞内脂滴形成情况3.2.1 不同浓度 OA 作用下 LO2 细胞内脂滴形成情况实验结果显示，正常对照组的 LO2 细胞核大，核膜完整，细胞内未见红色脂滴；0.25 mmol/L、0.5 mmol/L 的 OA 诱导后细胞浆内均有红色脂滴，脂滴和脂质含量随着 OA 浓度的增大而增加，呈浓度依赖性，说明肝脂肪变性细胞模型建立成功。结果如图 1-1，表 1-3 所示。

脂滴,形成情况,脂质含量,委陵菜

2018 届硕士研究生学位论文委陵菜积雪草酸对非酒精性脂肪肝细胞脂质代谢的影响及作用机制研究实验结果显示，正常对照组的 HepG2 细胞边缘清晰，核膜完整，细胞内未见红色脂滴。0.25 mmol/L、0.5 mmol/L 的 OA 诱导后细胞浆内均有红色脂滴，脂滴和脂质含量随着 OA 浓度的增大而增加，且呈浓度依赖性，说明肝脂肪变性细胞模型建立成功。结果如图 1-2，表 1-4 所示。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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