金丝桃苷调控AMPK-ULK1介导自噬改善D-半乳糖诱导肾脏衰老与损伤的作用和机制

发布时间：2020-06-04 13:25

【摘要】：[背景/目的]有关衰老分子机制的学说包括经典的“炎症反应”、“氧自由基学说”、“DNA甲基化”等,新近还有“自噬学说”、“衰老表型分泌”、“Klotho-FGF23轴”等观点。最新研究发现,自噬被激活能引起肾小球系膜细胞发生细胞程序性死亡,诱导肾小管损伤。一些研究发现中药单体及提取物能够通过调控自噬有关信号通路抗衰老,如冬虫夏草、白藜芦醇、金丝桃苷等。本文分为两部分,第一部分,主要阐明近年来衰老的分子机制及中药的干预作用。生理性衰老是组织、器官、细胞随时间推移功能逐渐减退的渐进过程,而在一些致病因素影响下可加速衰老进程,促进衰老相关病理产物生成,此称之为病理性衰老,而肾脏是易受衰老与损伤影响的典型靶器官。第二部分,作者借用D-gal诱导肾脏衰老和损伤模型,在体内与体外实验中,揭示金丝桃苷可能通过调控自噬抗衰老的作用和机制。[方法]将体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常组、D-gal组、低剂量金丝桃苷组、高剂量金丝桃苷组和VE组,分别进行不同的干预。具体而言,正常组加入1%胎牛血清1 mL;D-gal组加入100 mmol·L-1 D-gal;低剂量金丝桃苷组加入100 mmol·L-1 D-gal+5 mg·L-1金丝桃苷;高剂量金丝桃苷组加入100 mmol-L-1 D-gal+10 mg-L-1金丝桃苷;VE组加入100 mmol·L-1 D-gal+50 mg·L-1VE。在干预后的24h,①观察D-gal对NRK-52E 细胞 Klotho,P53,P21,IL-1,TGF-β,MCP-1 蛋白表达水平、β-半乳糖苷酶染色、慢病毒感染以及AMPK-mTOR-ULK1信号活性的影响;②观察D-gal、金丝桃苷以及VE对NRK-52E细胞增殖活性的影响;③观察金丝桃苷、VE、CC对D-gal诱导的NRK-52E 细胞Klotho,P53,P21,IL-1,TGF-β,MCP-1蛋白表达水平、SA-β-gal 染色,以及LC3、Beclin1和AMPK-mTOR-ULK1信号活性的影响。在体内实验中,将SD大鼠分为5组,具体分组情况如下:正常组,D-gal 4周组,D-gal 8周组,D-gal+金丝桃苷组,D-gal+VE组,正常组给予蒸馏水喂养8周,D-gal 4周组给予D-gal 300mg/kg/d皮下注射4周;D-gal 8周组给予D-gal 300mg/kg/d皮下注射8周;D-gal+金丝桃苷组给予D-gal 300mg/kg/d皮下注射+金丝桃苷20mg/kg/d灌胃8周,VE组给予D-gal 300mg/kg/d皮下注射+VE 30mg/kg/d灌胃8周;在4周结束时,D-gal 4周组SD大鼠麻醉处死,8周结束时,所有剩余大鼠麻醉,通过腹腔注射氯胺酮和地西泮(1:1)麻醉所有大鼠,并通过心脏穿刺处死,收集血清和肾脏皮质部分,观察以上指标基础上,观察LC3、Klotho免疫组化表达以及Scr、BUN水平。[结果]D-gal诱导肾脏与肾小管上皮细胞发生衰老和损伤,Klotho蛋白表达下降,P53、P21蛋白表达上升,IL-1、MCP-1、TGF-β蛋白高表达,自噬标志性蛋白LC3、Beclinl表达升高,调控自噬相关信号蛋白,mTOR水平无变化,而AMPK-ULK1信号通路活性显著升高;加入金丝桃苷、VE后,以上指标均发生显著变化,发现金丝桃苷作用同VE类似,通过抑制AMPK-ULK1信号活性介导自噬改善D-gal诱导的肾脏衰老和损伤。[结论]金丝桃苷通过调节AMPK-ULK1信号通路,抑制自噬活性,同时在体内和体外中保护肾脏免于衰老和损伤。
【图文】：

究金丝桃苷、ＶＥ是否可以在体外减轻Ｄ－ｇａｌ诱导的肾小管细胞衰老和损伤。结果发现，逡逑将金丝桃苷、ＶＥ分别与Ｄ－ｇａｌ（邋１００邋ｍｍｏｌ．Ｌ邋４）联合干预细胞，在联合干预２４ｈ后，ＳＡ－ｐ－ｇａｌ逡逑强阳性染色结果显著改善（图３Ａ），和模型组相比，，差异具有统计学意义（，＜０．０５或逡逑＜０．０１）；同时观察Ｋｌｏｔｈｏ、ｐ２１、ｐ５３、ＩＬ－１和ＴＧＦ－ｐ蛋白发现，其蛋白表达水平均明显逡逑好转（图３Ｂ，３Ｃ，４Ａ，４Ｂ），同模型组组相比，差异具有统计学（＊／？＜０．０５或＊＊ｐ＜０．０１）。逡逑不同剂量的金丝桃苷（５，１０，１５ｍｇ‘Ｌ－１）、ＶＥ（１５，邋２５，ＳＯｍｇ．Ｌ＊１）与邋Ｄ－ｇａｌｌ００ｍｍｏｌ－Ｌ逡逑－１联合干预细胞２４邋ｈ后，细胞墙殖活性没有明显变化（图３Ｄ，Ｅ）。此外，Ｄ－ｇａｌ和化合逡逑物Ｃ邋（ＣＣ，ＡＭＰＫ的抑制剂）联合干预细胞２４ｈ，与金丝桃苷、ＶＥ相似，ＮＲＫ－５２Ｅ细逡逑胞中的ｐ５３、ｐ２１、ＩＬ－１和ＴＧＦ－Ｐ蛋白表达水平明显下降（图４Ｃ，邋Ｄ），与模型组相比，逡逑差异具有统计学意义（Ｖ＜0．0５或＊＊ｐ＜０．０１）。逡逑２６逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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1 刘不悔;金丝桃苷调控AMPK-ULK1介导自噬改善D-半乳糖诱导肾脏衰老与损伤的作用和机制[D];南京中医药大学;2019年

本文编号：2696455