以PPARγ为靶标的二十二碳六烯酸抗肝纤维化作用研究

发布时间：2020-06-05 18:43

【摘要】：肝纤维化是细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的生成和降解失衡,汇管区和肝小叶内有大量以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的纤维组织增生与沉积的病理过程。肝纤维化是各种原因引起的慢性肝病发展为肝硬化及肝细胞癌的基础和必经阶段,其病理改变可以逆转。肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)被激活,转化为成纤维细胞是肝纤维化的核心环节。HSCs位于Disse隙内,其激活和转化受多因子和多途径调节。本课题组前期对中药姜黄的主要成分姜黄素的抗肝纤维化作用和分子机理进行了大量研究,认为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是控制HSCs活化的“开关”分子。而海洋化合物二十二碳六烯酸(DHA)是PPARγ的天然配体。因此,本论文提出DHA可以通过激活PPARγ从而抑制HSCs的活化,改善肝纤维化的科学假说。本论文首先以体内模型研究了 DHA对肝纤维化的改善作用。以腹腔注射四氯化碳(CC14)的方法建立大鼠肝纤维化模型,造模同时给予DHA预防性治疗。结果表明,DHA能够明显减轻大鼠肝损伤,减少肝脏胶原含量并改善肝纤维化指标。在mRNA和蛋白两个层面上,DHA给药使肝纤维化大鼠肝脏PPARy表达显著升高,同时Tβ-RI,Tβ-RII以及PDGF-βR表达降低。因此,我们推断DHA可能通过调控HSCs中的PPARy从而抑制TGF-β和PDGF通路,改善肝纤维化。体外大鼠HSC-T6细胞系的实验进一步证实,DHA可以上调PPARy,阻断TGFβ下游的Smad2/3和以及PDGF下游的细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化,从而抑制HSCs活化。在此基础上,本论文对DHA抑制HSCs活化进行了机理研究。结果发现,DHA可以通过调控AKT/FOXO1/p27信号通路抑制HSCs增殖。同时,DHA给药可以上调BAX,下调Bcl-2,诱导HSCs凋亡。拮抗PPARγ基本抵消了 DHA抑制HSCs活化的作用。因此认为,DHA通过PPARy依赖性的机制抑制HSCs增殖的同时促进HSCs凋亡,进而抑制HSCs的活化。计算机分子对接结果显示,DHA可以与PPARy结构的活性位点之间产生较好的结合作用,PPARy可能是DHA的直接作用靶标。为了验证分子对接的结果,我们构建了 Ser289突变的PPARy质粒。Western Blot的结果表明,转染Ser289突变的PPARy使LX-2的PPARγ蛋白表达显著升高,但肝纤标志蛋白a-平滑肌肌动蛋白(a-Smooth MuscleActin,a-SMA)和Fibronectin的表达却没有因此而降低。提示,与Ser289等氨基酸残基形成氢键是DHA激活PPARγ所必须的诱导契合机制之一。最后,我们以小鼠肝纤维化模型验证DHA的抗肝纤维化作用依赖于PPARγ的激活。综上所述,本论文的研究明确了海洋化合物DHA对肝损伤具有一定的保护作用,并进一步证明DHA可能通过激活PPARγ,抑制HSCs活化,进而缓解肝纤维化的分子机理。本论文的研究为海洋药物的开发提供了理论和实验依据。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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