血府逐瘀胶囊干预SIRT1与心脏干细胞改善心肌梗死预后功能的机制研究

发布时间：2020-06-05 19:05

【摘要】：研究背景:影响心肌梗死(MI)预后的主要病理因素是受损心肌功能丧失,如何促进心肌细胞再生是影响预后的关键。已知SIRT1(Silent mating type information regulation 2 homolog-1)能在应激条件下减少细胞凋亡,而心脏干细胞有研究证实也可分化为良好的心肌。中药在MI治疗中有着重要地位,课题组通过前期国家自然基金资助项目发现祛瘀生新法能调控SIRT1抑制细胞凋亡,促进干细胞修复受损心肌,但SIRT1与心脏干细胞在MI中的相关性尚无报道。目的:1.通过血府逐瘀胶囊对大鼠心肌梗死模型的干预治疗,观察其疗效并揭示该疗效与SIRT1表达、C-kit+/Lin-干细胞功能调节三者之间的内在联系。2.阐述“心肌梗死能诱使心脏干细胞增殖,SIRT1表达增多可提高心脏干细胞再生能力,祛瘀生新法则具有靶向SIRT1-心脏干细胞效应,从而实现共同修复缺血坏死心肌的作用”假说的科学内涵。3.揭示基于祛瘀生新视角的血府逐疲胶囊疗效机制,为防治心肌梗死提供新思路,结合转化医学促进中医药应用于再生医学。方法:1.心肌梗死模型构建:采用结扎冠状动脉左前降支方法制备心肌梗死模型。选用的大鼠为SPF级健康雄性WISTAR大鼠,200只,体重230±10g。2.实验分组及给药方式:共造模200只,成活104只,手术成活率为52%。按随机数字表法将造模成功大鼠分为以下八组:模型7天组,血府逐瘀胶囊低剂量7天组,血府逐瘀胶囊中剂量7天组,血府逐瘀胶囊高剂量7天组,模型28天组,血府逐瘀胶囊低剂量28天组,血府逐瘀胶囊中剂量28天组,血府逐瘀胶囊高剂量28天组,加上假手术7天组、假手术28天组,共十组。造模后于第12h后行心电图检查,根据心电图ST段抬高和I、AVL、V1-V6导联出现6-8个病理性Q波数量筛选模型,判断心梗的严重程度,剔除梗死程度太重或太轻的大鼠,最终纳入观察动物总数为64只。采用灌胃的方式给药。假手术组:每日以与药物组等容量无菌蒸馏水灌胃,模型组:每日以与药物组等容量无菌蒸馏水灌胃,血府逐瘀胶囊低剂量组:0.216g/kg/次、2ml/次、2次/d,血府逐瘀胶囊中剂量组:0.432g/kg/次、2ml/次、2次/,血府逐疲胶囊高剂量组:0.864g/kg/次、2ml/次、2 次/d。3.心电图检测:分别于造模手术前,术后12h对大鼠进行心电图检测。4.超声检测:采用Vevo 770高分辨率超声影像系统分别于给药7天和28天后对7天组和28天组实验动物进行超声检查。检测指标为左心室后壁舒张末厚度(LVPWd)、左室前壁舒张末厚度(LVAWd)、左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs),并计算左室短轴率(FS)、左室射血分数(EF)。5.荧光法测心肌梗死面积:采用Fx Pro型号的小动物活体成像对等厚的5片心肌组织进行荧光照射,检测心肌梗死面积。6.TUNEL法检测心肌细胞凋亡。7.实时荧光定量PCR法检测SIRT1、Fox01、C-kit mRNA表达。8.蛋白质免疫印迹(Western-blotting)法检测SIRT1、Bcl-xL等蛋白的表达。9.免疫组化法检测SIRT1、Bcl-xL等蛋白的表达。10.活性氧簇测定心肌梗死后R0S释放。结果:1.心脏超声结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组左室舒张末内径(LVIDd)、左室收缩末内径(LVIDs)显著增加,差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组、血府逐瘀胶囊中剂量组LVIDd、LVIDs有减小趋势,且血府逐瘀胶囊低剂量组LVIDd减小差异具有统计学意义(P0.05),血府逐瘀胶囊中剂量组LVIDs减小差异具有显著统计学意义(P0.01);心肌梗死后28天,模型组LVIDd、LVIDs比假手术组显著增加(P0.01),与模型组相比,给药组LVIDd、LVIDs减小差异具有显著统计学意义(P0.01),且与血府逐瘀胶囊中剂量组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组LVIDs减少有显著统计学意义(P0.01)。2.心脏超声结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组左室射血分数(EF)、左室短轴率(FS)显著降低,差异有统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组EF升高差异具有统计学意义(P0.05),血府逐瘀胶囊低剂量组、血府逐瘀胶囊中剂量组FS升高差异具有显著统计学意义(P0.01),且与血府逐瘀胶囊中剂量组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组EF升高差异有统计学意义(P0.05),FS升高差异有显著统计学意义(P0.01);心肌梗死后28天,模型组EF、FS比假手术组显著降低(P0.01,P0.05),与模型组相比,给药组EF、FS有增加趋势,且血府逐瘀胶囊低剂量组、血府逐瘀胶囊中剂量组EF、FS比模型组显著增加(P0.01),与血府逐瘀胶囊中剂量组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组FS升高差异有统计学意义(P0.05)。3.荧光法测心肌梗死面积结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组心肌梗死面积显著增加,差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,给药组心肌梗死面积有减小趋势;心肌梗死后28天,模型组心肌梗死面积比假手术组显著增加(P0.01),与模型组相比,给药组心肌梗死面积有减小趋势,且血府逐瘀胶囊低剂量组差异具有统计学意义(P0.05)。4.TUNEL结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组凋亡率显著增加(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组心肌细胞凋亡率降低且差异有显著统计学意义(P0.01);心肌梗死后28天,模型组凋亡率明显增加且差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组凋亡率显著降低且差异有统计学意义(P0.05)。5.心肌组织PCR结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组SIRT1、C-kit表达显著降低(P0.01,P0.05),Fox01表达显著增加(P0.01),给予血府逐瘀胶囊干预后,SIRT1、C-kit表达明显增加(P0.05,P0.01),Fox01表达明显降低(P0.01);心肌梗死后28天,模型组SIRT1、C-kit表达比假手术组显著降低(P0.01,P0.05),Fox01表达显著增加(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组SIRT1、C-kit表达明显增加(P0.01),Fox01 表达明显降低(P0.01)。6.心肌组织Bax、Bcl-xL蛋白表达结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组Bax蛋白表达显著增加、Bcl-xL蛋白表达显著降低且差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组Bax蛋白表达明显降低且差异有显著统计学意义(P0.05),Bcl-xL蛋白表达显著增加且差异有统计学意义(P0.05);心肌梗死后28天,模型组Bax蛋白表达比假手术组显著增加、Bcl-xL蛋白表达显著降低且差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐疲胶囊组Bax蛋白表达显著降低、Bcl-xL蛋白表达显著增加且差异有显著统计学意义(P0.05)。7.心肌组织Caspase-3、Fas蛋白表达结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组Caspase-3、Fas蛋白表达显著增加并且Caspase-3蛋白表达差异有显著统计学意义(P0.01)、Fas蛋白表达差异有统计学意义(P0.05),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组Caspase-3蛋白表达降低且差异有统计学意义(P0.05),Fas蛋白表达显著降低且差异有显著统计学意义(P0.01);心肌梗死后28天,模型组Caspase-3、Fas蛋白表达比假手术组显著增加且差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组Caspase-3、Fas蛋白表达显著降低且差异有显著统计学意义(P0.01)。8.心肌组织SIRT1、S0D2蛋白表达结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组SIRT1、S0D2蛋白表达明显减少并且差异有统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组SIRT1、S0D2蛋白表达显著增加且差异有统计学意义(P0.05);心肌梗死后28天,模型组SIRT1、SOD2蛋白表达比假手术组显著减少且差异有显著统计学意义(P0.01,P0.05),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组SIRT1、S0D2蛋白表达明显增加且差异有显著统计学意义(P0.01)。9.心肌组织Fox01、P53蛋白表达结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组Fox01蛋白表达显著增加(P0.01)、P53蛋白表达明显增加(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组Fox01蛋白表达减少且差异有统计学意义(P0.01)、P53蛋白表达显著减少且(P0.01);心肌梗死后28天,模型组Fox0l、P53蛋白表达比假手术组显著增加且差异有显著统计学意义(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组Fox0l、P53蛋白表达显著减少且Fox01蛋白表达减少差异有显著统计学意义(P0.01)、P53蛋白表达减少差异有统计学意义(P0.05)。10.免疫组化采用测量单位光密度值(Density)的方法检测阳性细胞的着色强度,并计算其相对光密度值,结果显示,7天、28天各时间点模型组SIRT1、Bcl-xL染色强度降低,Fas、P53染色强度增强,差异有统计学意义(P0.05),给予血府逐瘀胶囊干预后,血府逐瘀胶囊组SIRT1、Bcl-xL染色强度较模型组显著增强(P0.05),Fas、P53染色强度较模型组显著降低(P0.05)。11.R0S测定结果显示,心肌梗死后7天、28天各时间点,与假手术组相比,模型组R0S明显增加(P0.01),与模型组相比,血府逐瘀胶囊组ROS显著减少(P0.05)。结论:1.血府逐瘀胶囊通过改善心室重构,提高心功能,从而发挥其心脏保护作用。2.血府逐瘀胶囊通过抗心肌细胞凋亡,减小心肌梗死面积,从而发挥其心脏再生作用。3.血府逐瘀胶囊具有改善心室重构,抗心肌细胞凋亡作用,其机制可能与其抑制ROS生成有关。4.血府逐瘀胶囊具有抗心肌细胞凋亡,促进心脏干细胞再生的作用。5.SIRT1表达增多可提高心脏干细胞再生能力,血府逐瘀胶囊可能具有靶向SIRT1-心脏干细胞效应,从而实现共同修复缺血坏死心肌的作用。6.SIRT1通路可能成为保持心脏干细胞功能的潜在目标。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】