天麻素对氧糖剥夺再复供损伤大鼠皮层神经细胞保护作用的转录组学研究

发布时间：2020-06-06 14:14

【摘要】：缺血性脑血管病是供应大脑血液的血管血流量降低或者完全闭塞所致脑组织变性、坏死而引起的一系列症状或体征,具有较高病死率,即使抢救及时也可能出现瘫痪、失语、痴呆等后遗症,属于中医“中风”范畴。天麻(Gastrodia elata Bl.)有“治风神药”之称,是临床治疗脑缺血/再灌注损伤常用中药之一。为了进一步探究天麻防治功效的分子生物学机制,本论文以大鼠原代皮层神经细胞为实验对象,采用高通量RNA-Seq测序分析技术对天麻中具有潜在抗脑缺血作用的关键活性成分天麻素进行了研究,以期在转录组水平上探索天麻对损伤神经细胞的保护作用机理,为天麻应用于临床脑缺血疾病治疗提供理论支持。方法:1.培养大鼠原代皮层神经细胞,以连二亚硫酸钠(Na_2S_2O_4)联合无糖Earle's液构建氧糖剥夺再复供(oxygen-glucose deprivation and reperfusion,OGD/R)损伤模型,随机分为空白组、模型组、天麻素低、中、高剂量组,采用MTT法测定各组皮层细胞存活率,试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。2.对空白组、模型组及天麻素预给药实验组大鼠皮层神经细胞分别进行总RNA提取—反转录—cDNA文库构建,使用HiSeq X-ten平台进行高通量测序,构建大鼠皮层细胞的转录本数据库。通过功能注释、差异表达基因分析、代谢通路富集分析筛选出天麻素对OGD/R损伤皮层细胞发挥保护作用的相关基因与代谢通路。3.采用QRT-PCR技术对上一步骤筛选出的部分候选基因的mRNA表达水平进行转录活性验证。结果:1.以8 mM Na_2S_2O_4联合无糖Earle's液进行造模,细胞经氧糖剥夺1 h再复供2 h存活率为50%~60%,为原代皮层神经细胞OGD/R造模的最适条件。2.OGD/R损伤后大鼠皮层细胞活性显著下降,LDH释放增加,而天麻素预处理能提高细胞存活率,并显著下调LDH漏出率。3.高通量RNA-seq测序共获得260,098,083个高质量碱基序列,76,943,018,898 bp碱基数,Q30碱基百分比在90.32%及以上,各样品的Reads与参考基因组的比对效率在81.19%~83.21%之间,比对效率较高。4.在FDR
【图文】：

胞体,成都中医药大学,神经元形态,硕士学位论文

成都中医药大学 2018 届硕士学位论文突起，细胞呈圆形或椭圆形；培养 3 d 细胞突起增长，胞体饱满，边缘折光率较高，呈现典型神经元形态特征；培养 5 d 细胞基本成熟，胞体增大，，立体感较强，相邻神经元突起连接呈现网状结构；培养 7 d 神经元足够成熟（见图 1-1），可用于实验。

免疫荧光,存活率,损伤作用,图像

图 1-2 原代皮层神经细胞 NSE 免疫荧光鉴定神经元突起；B：DAPI 染色细胞核 DNA；C immunofluorescence identification of primary coeuron protruding; B:DAPI stained nucleus DNA; Na2S2O4对皮层神经细胞的损伤作用测定细胞线粒体活性，以空白组细胞存活率胞存活率的影响。由表 1 可知，氧糖剥夺再复供一定的损伤作用，随着 Na2S2O4浓度的增加，细为 8 mM 时，细胞相对存活率为 56.19±6.29%，因此，后续实验造模条件选择 8 mM Na2S2O4。浓度 Na2S2O4对皮层神经细胞活性及存活率的影响（s of different concentrations of Na2S2O4on the activity acortical neurons ( x±s，n=6)
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】