盐酸常山碱不同脂质体及聚乙二醇结合物的构建及评价

发布时间：2020-06-06 17:20

【摘要】：疟疾是目前世界上发病率最高的热带病,在导致死亡的主要传染病中排名第四位。但2018年WHO的《世界疟疾报告》显示,近几年全球疟疾防治没有取得任何重大进展。尤其是青蒿素、氯喹等显现出耐药性,使得疟疾的防治工作面临越来越大的挑战。因此新型抗疟药的研发,对世界范围内疟疾的消除起着重要作用。常山碱是从中药常山中提取的一种喹唑酮型生物碱,具有很强的抗疟活性。但由于其严重的呕吐、胃肠道损伤、肝损伤等毒副作用,以及药物化学性质的不稳定性,限制了其临床应用。作者团队前期的研究中将其制备成常山碱盐酸盐(Dichroa alkali salt),解决了常山碱稳定性差的问题。并在研究中发现,静脉注射给药能显著降低DAS的毒副作用,但同时抗疟药效明显降低。本课题选择研究了脂质体药物递送系统和聚乙二醇化这两种具有较好临床转化前景的方式,构建了 DAS普通脂质体、具有缓释作用的聚乙二醇化脂质体、DAS-姜黄素复合脂质体和具有疟原虫感染红细胞靶向作用的靶向脂质体,以及三种不同分子量的PEG化常山碱,并对其体内外的药效和毒性进行评价。旨在利用这几种剂型各自不同的特点,通过多方面的探索和比较,寻找一种有效的方法,提高DAS静脉注射的抗疟药效,并进一步降低DAS引起的毒副作用,将DAS开发为一种低毒高效的静脉注射制剂,作为无法口服药物的疟疾重症患者的治疗用药。主要研究内容如下:建立了 DAS含量测定的HPLC分析方法,并进行方法学考察。结果显示,该方法在检测范围内线性关系良好,重现性,精密度,方法回收率等均符合含量测定要求。对DAS理化性质进行考察,结果显示,DAS油水分配系数具有明显的pH依赖性,在正辛醇一水相中的亲水亲油平衡值(1gP)值随水相pH值增大而增大。对比DAS在120℃高压蒸汽灭菌15min后的回收率。结果表明,DAS回收率在37.16-57.91%之间,在pH4-9范围内,DAS在高温高压环境下化学性质并不十分稳定。对DAS脂质体包封率测定方法进行筛选,考察葡聚糖凝胶微柱离心法和阳离子交换树脂微柱离心法。结果表明,两种方法均重现性良好,且操作简便,快捷。综合考虑,选择成本更低的阳离子交换树脂微柱离心法测定脂质体包封率。对DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体处方工艺进行筛选,考察了磷脂种类、胆固醇用量、磷脂浓度、水化液浓度、药脂比、载药温度、载药时间等因素对DAS普通脂质体包封率的影响;载药方法、磷脂种类、内水相pH、内水相缓冲液浓度、DSPE-PEG2000用量、透析液种类、药脂比等因素对聚乙二醇化脂质体包封率的影响,分别确定了两种脂质体的最佳制备工艺。对DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体的表征进行评价,冷冻透射电镜(Cryo-TEM)显示,两种脂质体均为球形的单室脂质体,平均粒径分别为126.23和114.93 nm,且都具有较好的粒度分布。DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体均表面带负电,zeta电位分别为-6.25和-26.33 mV,包封率分别为89.43和96.42%。用透析袋法对两种脂质体的体外释放行为进行考察,DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体在体外均有明显的缓释作用,且聚乙二醇化脂质体的缓释作用更显著。考察了两种脂质体的储存稳定性,两种脂质体在4℃条件下,粒径,粒度分布,Zeta电位在60天的考察时间内都没有明显变化,储存稳定性较好。对DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体进行体内外药理学评价,用MSF法考察了 DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体对恶性疟原虫3D7菌株的体外抗疟活性,两种脂质体都显著增强了体外抗疟活性(P0.01),其中聚乙二醇化脂质体的抗疟活性更好。用MTS法测定DAS药物溶液、DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体对HUVEC的细胞毒性。结果发现,聚乙二醇化脂质体细胞毒性明显低于DAS药物溶液和普通脂质体(P0.05),DAS药物溶液和普通脂质体细胞毒性无显著性差异。DAS药物溶液、DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体溶血实验表明,在37℃下孵育1,3,6h后,除DAS普通脂质50μg·mL-组外,其他各组样品的溶血率均小于5%,说明DAS,DAS普通脂质体及聚乙二醇化脂质体的血液相容性较好,可用于静脉注射给药。采用Peter's四天抑制实验法对DAS药物溶液、普通脂质体和聚乙二醇化脂质体的体内抗疟活性进行研究。DAS、普通脂质体与聚乙二醇化脂质体的ED50分别为10.8、5.48和1.9 mg·kg-1。DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体的体内抗疟药效分别是原料药的2倍和5倍,药效显著提高。DAS、DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体静脉注射给药的急性毒性实验中,DAS、普通脂质体与聚乙二醇化脂质体的LD50值为18.95、19.14、5.52 mgkg-1。对死亡小鼠进行解剖,各组死亡小鼠都有明显的胃肠道损伤。说明DAS和DAS普通脂质体急性毒性相近,而聚乙二醇化脂质体毒性明显高于前两者。根据体内药效学实验和急性毒性实验的数据进行治疗指数(TI)分析,DAS、普通脂质体和聚乙二醇化脂质体的治疗指数分别为1.75、3.49、2.77。虽然聚乙二醇化脂质体抗疟活性最好,但由于急性毒性过大,其安全性低于DAS普通脂质体。但与DAS相比,两种制剂的安全性都明显提高。由于与DAS和聚乙二醇化脂质体相比,DAS普通脂质体具有更好的安全性。故在普通脂质体处方的基础上,与姜黄素联用,制备了 DAS-姜黄素复合脂质体。旨在利用姜黄素的抗疟,保肝,胃肠道保护等特点,制备一种药效更高,毒性更低的脂质体制剂。复合脂质体用分步载药的方法进行制备,并对脂质体的表征及体内外药理学性质进行评价。脂质体中姜黄素和DAS包封率均大于80%。脂质体多为表面光滑圆整的单室脂质体,少数为双层的多室脂质体。粒径在10 nm左右,粒度分布小于0.3,脂质体表面带负电荷。用MSF法考察了复合脂质体对恶性疟原虫3D7菌株的体外抗疟活性,其体外抗疟活性显著高于DAS原料药(P0.01)。对HUVEC细胞的细胞毒性实验结果显示,其细胞毒性明显低于DAS原料药(P0.01)。采用Peter's四天抑制实验法考察其体内抗疟活性,其体内抗疟活性的EDs0为5.64 mg·kg-1,其抗疟药效高于DAS原料药(ED50为10.8 mg·kg-1),与DAS普通脂质体(ED50为 5.48mg·kg-1)接近。对复合脂质体急性毒性进行研究,其LD50为30.25 mg·kg-1,约为DAS普通脂质体(LD50为19.14mg·kg-1)及DAS原料药(LD50为18.95mg·kg-1)的1.5倍。说明复合脂质体在不影响DAS药效的前提下,明显降低了静脉注射给药的毒性。复合脂质体的治疗指数TI为5.36,不但高于DAS原料药,还明显高于DAS普通脂质体和聚乙二醇化脂质体。靶向脂质体可以将药物定向的运送到靶器官或靶组织,在局部给予足够剂量的同时,降低了药物对其他组织和器官的毒性。因此我们对靶向于疟原虫感染红细胞的DAS pRBCs靶向脂质体进行初步研究。首先进行处方工艺筛选,考察了水化液种类,磷脂浓度,胆固醇用量,药脂比等因素对脂质体包封率的影响,构建了以胆固醇和阳离子磷脂DOPC、DOTAP为膜材的阳离子脂质体。分别将带负电荷的透明质酸和肝素钠与阳离子脂质体在一定条件下孵育,使其静电结合于阳离子脂质体表面。构建透明质酸介导的pRBCs 靶向脂质体(DAS-HA-Lip)与肝素钠介导的pRBCs靶向脂质体(DAS-DAS-Hep-Lip)。Cryo-TEM显示,两种脂质体皆为球形或类球形的单室脂质体。粒径在150 nm左右,粒度分布均小于0.3,表面带正电荷。采用Peter's四天抑制实验法进行小鼠体内抗疟活性研究,在1.5 mg·kg-1的剂量时,DAS-DAS-Hep-Lip组小鼠转阴率为30%,DAS-HA-Lip组小鼠转阴率为40%。在3 mg·kg-1的剂量时,DAS-DAS-Hep-Lip组小鼠转阴率为40%,DAS-HA-Lip组小鼠转阴率为80%。在两种剂量下,原料药组小鼠转阴率均为0%。说明两种脂质体均可以明显的增强体内抗疟效果,而DAS-HA-Lip抗疟效果更强。大量研究表明,药物经过PEG修饰后,可以改变其在体内的分布和代谢特征,增加药物药效,降低其毒副作用。而且相较于脂质体,与药物以共价键结合的PEG化制剂化学性质更为稳定,成药性更强。因此,我们将DAS分别与分子量为1000,5000,20000的聚乙二醇(PEG)共价结合,合成了 PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS三种不同分子量的PEG化常山碱制剂,并对三种制剂进行体内外药效与毒理学评价。PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS对恶性疟原虫3D7菌株的体外抗疟活性实验结果显示,PEG-1K-DAS无明显的抗疟活性,PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS体外抗疟IC50分别为19.88±1.08,11.42±0.980nM,体外抗疟活性明显低于DAS原料药(P0.01)。通过对HUVEC细胞的细胞毒性研究发现,PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS的细胞毒性均明显低于DAS原料药(P0.01),并且三种PEG化常山碱的细胞毒性PEG-2W-DASPEG-5K-DASPEG-1K-DAS。对 PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS 的溶血性进行评价,在 37℃下孵育 1,3,6 h后,三种样品的溶血率均小于5%,说明三种PEG化常山碱的血液相容性较好,可用于静脉注射给药。采用Peter's四天抑制实验法,对三种PEG化常山碱的体内抗疟活性进行研究,PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS有一定抗疟效果,PEG-1K-DAS虽然可以明显降低染虫率,但是在实验剂量内,转阴率为0%,PEG-5K-DAS在6 mg·kg-1的转阴率为20%。抗疟效果最好的是PEG-2W-DAS,其抗疟药效的ED50为1.08 mg·kg-1,体内抗疟活性约为DAS原料药的10倍。由于PEG-2W-DAS抗疟效果最显著,故对其进行急性毒性研究。研究发现,其静脉注射给药的LD50为5.08 mg·kg-1,毒性较大,对死亡组小鼠进行解剖,其主要死亡原因也是严重的胃肠道损伤。但结合体内药效实验结果可以算出,PEG-2W-DAS的治疗指数TI值为4.72,与DAS原料药(TI=1.75)相比,安全性明显提高。
【图文】：

照片,脂质体,铜网,照片

（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）确定，取脂质体混悬液适量，滴加在铜网上，使其在铜网上形成逡逑尽量薄的一层薄膜。迅速将铜网置于液氮中降温，于冷冻透射电镜中观察ＤＡＳ逡逑普通脂质体和聚乙二醇化脂质体形态。结果如图２－１所示，两种脂质体都是表面逡逑光滑圆整的球形单室脂质体。逡逑３９逡逑

粒度分布,脂质体,释放度,溶液

ＰＥＧｙｌａｔｅｄ邋ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ邋（邋ｎ＝３）逡逑ＤＡＳ溶液，ＤＡＳ普通脂质体和ＤＡＳ聚乙二醇化脂质体体外释放行为考察的逡逑结果如图２－２所示，ＤＡＳ溶液在ＰＢＳ中释放最快，在ｌｈ后ＤＡＳ的释放率就己逡逑达到９２．８４±２．１０％，远高于ＤＡＳ普通脂质体（２５．８８±１．５８％）和聚乙二醇化脂质逡逑体（７．９８±０．２％邋）。实验２４邋ｈ后，普通脂质体中的ＤＡＳ释放增加至２４．９８±１．８１邋％，逡逑而聚乙二醇化脂质体中的ＤＡＳ释放率仅为４２．３０士２．５５％。ＤＡＳ的释放率：ＤＡＳ逡逑溶液（９０．２３±０．６８％）邋＞普通脂质体（２４．９８±１．８１％）邋＞聚乙二醇化脂质体逡逑（４２．３０±２．５５％）。该实验结果表明，与ＤＡＳ溶液相比，ＤＡＳ普通脂质体和聚乙逡逑二醇化脂质体均具有一定的缓释能力，并且聚乙二醇化脂质体的缓释能力更加显逡逑著。逡逑２．３．５脂质体储存稳定性考察逡逑为了安全有效地使用脂质体，考察其稳定性至关重要。本实验考察了邋ＤＡＳ逡逑普通脂质体和ＤＡＳ聚乙二醇化脂质体在４邋°Ｃ下储存６０天后的储存稳定性，，并测逡逑定它们的平均粒径，粒度分布，ｚｅｔａ电位和包封效率。逡逑４２逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

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