双氢青蒿素调控肝星状细胞自噬与衰老发挥抗肝纤维化作用的分子机制研究

发布时间：2020-06-07 02:29

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是各种慢性肝病发展为肝硬化(hepatocirrhosis)甚至肝癌(hepatocarcinoma,HCC)所必须经历的共同病理过程,如何有效防治肝纤维化是困扰当今医学界的世界性难题。肝纤维化的发病实质是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积,而活化型肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是ECM最主要的细胞来源,因此靶向清除活化型HSC,进而从源头阻断ECM过度沉积,被认为是防治肝纤维化的主要策略。细胞衰老(cell senescence)是指在某些应激条件下,细胞从正常分裂状态不可逆转地脱离细胞周期,进入一种相对稳定的增殖停滞状态。细胞自噬(autophagy)主要由双层膜结构包裹衰老或受损的细胞器、蛋白质、病原微生物等形成自噬溶酶体,然后利用溶酶体中的各种水解酶降解所包裹的内容物,为细胞提供物质与能量来源。细胞自噬与细胞衰老均是细胞应对内外环境改变的重要调节机制,并且两者之间存在共同的信号通路。近年来的研究成果表明细胞自噬可以调控细胞衰老进程,细胞自噬已经成为当前衰老与抗衰老研究的潜在突破点。如果使用适宜的药物靶向调控HSC细胞自噬通路,进而诱导HSC发生细胞衰老,将能够阻断HSC过度增殖,减少ECM沉积,缓解肝纤维化病理改变。本课题组前期研究发现,传统中药活性成分双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)能够显著改善肝纤维化病理损伤,也能够激活HSC细胞自噬通路。考虑到细胞自噬、细胞衰老与肝纤维化的密切相关,本论文创新性地提出科学假说:双氢青蒿素可能通过调控细胞自噬与细胞衰老信号网络发挥抗肝纤维化作用。本论文将重点围绕这一科学假说深入揭示双氢青蒿素抗肝纤维化的潜在分子机制。本论文首先明确双氢青蒿素在体内外均能够改善肝纤维化病理损伤。按照文献报道建立经典的四氯化碳(carbon tetrachloride,CC14)致大鼠肝纤维化模型,造模成功后腹腔注射不同剂量双氢青蒿素治疗4周。ELISA结果显示双氢青蒿素能够显著降低血清肝损伤指标ALT、AST、ALT、LDH及TBIL水平,也能够明显下调血清肝纤维化指标LN、HA、IV-C、PC-Ⅲ及HYP水平;肝组织病理学检查显示双氢青蒿素能够缓解肝脏纤维化病理改变,也能够减轻胶原过度沉积;Western blot、real-time PCR及免疫荧光结果显示双氢青蒿素能够显著抑制肝组织纤维化指标α-SMA、collagenl、fibronectin、TGF-βR1及PDGF-Rβ水平。从正常大鼠肝脏中分离静息型HSC,使用PDGF-BB体外刺激HSC活化,然后加入不同剂量双氢青蒿素进行干预处理。结果显示,双氢青蒿素能够剂量依赖性地下调HSC活化指标α-SMA、collagen1、fibronectin、desmin、TGF-βR及PDGF-Rβ表达水平。综合上述结果,双氢青蒿素具有优异的抗肝纤维化药理活性,这为本论文后续的分子机制研究提供坚实的药效学基础。本论文接下来明确双氢青蒿素是否通过调控HSC细胞自噬与细胞衰老信号网络发挥抗肝纤维化作用。按照上述方法建立大鼠肝纤维化模型,并采取治疗给药的方式给予双氢青蒿素。与此同时,从正常大鼠肝脏中分离静息型HSC,使用PDGF-BB体外刺激HSC活化,然后加入不同剂量双氢青蒿素进行干预处理。结果显示,双氢青蒿素在体内外均能够诱导HSC发生细胞衰老,且这一作用与其上调GATA6的表达有关。沉默GATA6能够削弱双氢青蒿素诱导HSC发生细胞衰老,过表达GATA6能够增强双氢青蒿素诱导HSC发生细胞衰老。更有趣地,细胞自噬通路的激活可能是双氢青蒿素诱导HSC细胞衰老与GATA6堆积的潜在机制,阻断细胞自噬通路能够削弱双氢青蒿素诱导HSC细胞衰老及GATA6堆积的作用。进一步的分子机制研究发现,双氢青蒿素通过增强细胞自噬水平,降解自噬底物p62,促进p62与GATA6的解离,导致GATA6堆积,进而触发细胞衰老的发生。细胞自噬通路特异性抑制剂3-MA、CQ、Bafilomycin A1或p62 plasmid均能够阻断p62的降解,进而削弱双氢青蒿素导致的HSC细胞衰老及GATA6堆积。综合上述结果,双氢青蒿素可能通过调控HSC细胞自噬与细胞衰老信号网络发挥抗肝纤维化作用。现已明确,衰老细胞典型特征表现为细胞周期的永久性停滞以及衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。细胞衰老一方面可以阻断受损细胞或癌细胞的增殖,另一方面可以通过SASP分泌各种炎症相关因子影响周围正常细胞功能。本论文紧接着明确双氢青蒿素能否通过激活细胞自噬通路抑制HSC炎症因子生成与释放。体内外实验均按照上述操作进行。结果显示,双氢青蒿素在体内外均能够抑制HSC炎症因子的生成与释放。有趣地,细胞自噬通路的激活可能与双氢青蒿素的这一药理效应有关。阻断细胞自噬通路能够削弱双氢青蒿素的抗炎效应,而上调细胞自噬通路能够增强双氢青蒿素的抗炎效应。进一步的分子机制研究发现,双氢青蒿素可能通过触发HSC细胞内ROS堆积,促进JNK1/2活化,转录表达自噬相关基因,激活细胞自噬通路,进而发挥抗炎效应。ROS清除剂NAC、GSH、Na Py、Cat或JNK1/2特异性抑制剂SP600125、JNK1/2 siRNA均能够削弱双氢青蒿素导致的细胞自噬通路激活以及抗炎效应。综合上述结果,双氢青蒿素可能通过激活细胞自噬通路抑制HSC炎症因子生成与释放。细胞发生衰老之后,虽然细胞周期处于停滞状态,但是仍然具有部分代谢活性,因此细胞衰老并不是细胞的最终命运。新近研究发现,衰老的细胞由于胞浆内铁离子水平显著升高,对铁死亡途径(ferroptosis)具有高度敏感性,如果使用适宜的药物调控铁代谢通路,可以诱导细胞衰老向细胞铁死亡的转换。本论文最后明确双氢青蒿素能否通过激活细胞自噬通路诱导HSC发生铁死亡。按照上述方法进行体内外实验。结果显示,双氢青蒿素在体内外均能够诱导HSC发生铁死亡,且这一作用与其激活细胞自噬有关。阻断细胞自噬能够削弱双氢青蒿素诱导HSC发生铁死亡,促进细胞自噬能够加强双氢青蒿素诱导HSC发生铁死亡。有趣地,双氢青蒿素可能通过上调NCOA4的表达水平,指引细胞自噬靶向识别并降解储铁蛋白FTH1,进而增加铁离子水平,导致铁死亡的发生。沉默NCOA4能够削弱双氢青蒿素导致的HSC铁死亡,但是过表达NCOA4能够增强双氢青蒿素导致HSC发生铁死亡的作用。本论文的研究结果能够在整体动物与细胞分子水平揭示细胞自噬与细胞衰老信号网络在肝纤维化病理进程中的关键作用,进一步阐明双氢青蒿素抗肝纤维化的分子机制,为将双氢青蒿素开发为抗肝纤维化的临床药物提供可靠的实验基础。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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本文编号：2700689