黄芩素通过自噬保护帕金森病小鼠神经损伤作用机制研究

发布时间：2020-06-08 14:53

【摘要】：背景:(1)帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)是一种好发于中老年人群的进行性锥体外系功能障碍的中枢神经系统退行性疾病。其临床特点是静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等,严重影响患者生活质量,增加家庭和社会负担。目前,仍以药物治疗为主,且药物或外科手术等治疗皆仅能缓解临床症状,没有任何治疗方法能够确切证明可减缓或阻止PD的进程,所以迫切需要更多针对此疾病的有效治疗。因此,对其病因、发病机制及治疗等仍需进一步深入研究。(2)细胞自噬在真核生物中广泛存在,是一种高度保守的细胞内受损细胞器及错误折叠蛋白质的降解过程。从粗面内质网脱落的双层膜包裹需降解成分形成自噬体,再与溶酶体融合而形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,降解产生的氨基酸以及其他一些小分子物质可被再利用或产生能量,实现细胞自身的代谢需要和某些细胞器的更新,维持细胞基本的生命活动。基础自噬对于神经元的稳态以及确保神经元正常细胞功能是必须的。自噬缺陷或不足将导致变性α-突触核蛋白(α-syn)等有害物质集聚,线粒体自噬异常影响细胞内功能障碍的线粒体的清除,并可引起PD。因此,自噬途径在PD发病机制中起重要作用,自噬调控可能是PD治疗的新策略。(3)黄芩素是一种黄酮类化合物,来自传统中草药黄芩的根。黄芩素可以通过抑制炎症反应、抗细胞凋亡和抗氧化等机理在PD模型中发挥神经保护作用。有研究发现黄芩素通过诱导保护性自噬,在抗肿瘤、肝脏局部缺血/再灌注损伤等方面发挥作用。然而,黄芩素的确切作用机制仍有待阐明,是否可作为保护性自噬诱导剂应用于PD治疗需进一步研究。目的:(1)本研究旨在观察黄芩素对神经细胞自噬的激活作用,探索其神经保护作用的新机制。(2)通过研究调节自噬对细胞凋亡及线粒体功能的影响,探讨黄芩素通过自噬保护PD神经损伤作用与对细胞凋亡及线粒体功能调节的关系。(3)本研究探索黄芩素通过自噬保护PD神经损伤的机制研究,为自噬调节剂作为PD治疗的新药物研发提供理论依据。方法:(1)PD小鼠模型制备、动物分组及药物处理:将12月龄健康雄性C57BL/6小鼠按完全随机方法分为6组——空白对照组、载体对照组、单纯黄芩素组、PD模型组、黄芩素+PD模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+黄芩素+PD模型组。PD模型组、黄芩素+PD模型组及3-MA+黄芩素+PD模型组小鼠每周给予鱼藤酮溶液(5mg/kg,0.01ml/g)灌胃5天,连续灌胃12周;黄芩素+PD模型组小鼠在给予鱼藤酮处理的第7周到12周,同时给予黄芩素(100mg/kg)腹腔注射处理;3-MA+黄芩素+PD模型组小鼠在给予鱼藤酮和黄芩素处理的第10周到12周,同时给予3-MA(100 mg/kg)腹腔注射处理;单纯黄芩素组小鼠在第7周到12周给予等剂量的黄芩素处理,载体对照组小鼠每周给予等体积载体对照溶液(O.O1ml/g)灌胃5天,连续灌胃12周;空白对照组小鼠不给予任何处理。为了检测小鼠自噬流水平,在小鼠处死收集标本前24小时给予小鼠腹腔注射氯喹(60mg/kg)。(2)行为学检测及多巴胺含量检测:所有行为学检测均在白天进行,且提前3天进行适应性训练,避免小鼠产生焦虑和恐慌,影响实验结果。采用滚轴试验和网格试验进行检测。小鼠大脑纹状体多巴胺(DA)含量采取高效液相色谱电化学法进行检测。(3)细胞培养、药物处理及实验细胞分组:体外培养SH-SY5Y细胞,接种适量的SH-SY5Y细胞于6孔或96孔细胞培养板中,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养24小时后,加入适量鱼藤酮溶液(2μmol/L)。为观察黄芩素可否减轻细胞损伤,培养液中加入黄芩素(10μmol/L)与鱼藤酮共培养,培养24小时后,检测细胞活性、凋亡及线粒体损伤情况;为观察黄芩素可否上调细胞自噬流,细胞在收集前6小时加入氯喹(10μmol/L)处理;为观察黄芩素可否通过上调自噬机制减轻细胞损伤,细胞在黄芩素处理前1小时给予自噬抑制剂3-MA(10mmol/L)处理;为观察上调自噬可否减轻细胞损伤,细胞在给予鱼藤酮刺激同时给予自噬诱导剂雷帕霉素(100 nmol/L)处理。实验细胞分为空白对照组、载体对照组、单纯黄芩素组、鱼藤酮组、黄芩素+鱼藤酮组、3-MA+黄芩素+鱼藤酮组及雷帕霉素+鱼藤酮组等7组。(4)细胞活力评估:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,同时检测细胞培养上清乳酸脱氨酶(LDH),对细胞毒性进行判断分析。(5)细胞凋亡评估:利用比色法测定caspase-3活性,利用蛋白质免疫印迹试验检测Cleaved caspase-3 蛋白表达。(6)线粒体功能检测:利用JC-1线粒体膜电位分析工具对线粒体膜电位进行测定。(7)细胞自噬检测:利用蛋白质免疫印迹试验检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)B蛋白表达。应用工具药(氯喹、3-MA、雷帕霉素)人为地调控自噬,观察体内体外模型中的变化。结果:(1)小鼠行为学检测:鱼藤酮诱发的PD模型组实验鼠僵直状态使得滚轴试验和网格试验中与空白对照组或载体对照组相比,掉落滚轴的延迟时间及掉落网格的延迟时间均明显缩短,黄芩素+PD模型组与PD模型组比较有显著改善。黄芩素防止鱼藤酮诱导PD模型小鼠的行为障碍。(2)小鼠纹状体多巴胺含量检测:PD模型组纹状体DA含量与空白对照组或载体对照组相比显著降低;黄芩素+PD模型组纹状体DA含量也降低,然而与PD模型组相比,有明显增高。黄芩素部分还原鱼藤酮诱导PD模型小鼠纹状体多巴胺含量。(3)小鼠纹状体区细胞凋亡评估:与空白对照组或载体对照组相比,PD模型组小鼠纹状体中的Caspase 3活性显著升高;黄芩素+PD模型组纹状体中的Caspase 3活性也升高,然而与PD模型组相比,有明显下降。此外,免疫印迹法分析显示类似的结果,鱼藤酮治疗使得Cleaved Caspase3蛋白表达升高,但此现象在黄芩素治疗后被明显抑制。黄芩素抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡。(4)小鼠纹状体细胞线粒体膜电位检测:PD模型组与空白对照组或载体对照组相比,其纹状体线粒体膜电位降低;黄芩素+PD模型组线粒体膜电位也降低,然而与PD模型组相比,有明显增高。黄芩素防止鱼藤酮诱导的线粒体功能障碍。(5)黄芩素对小鼠纹状体细胞自噬的影响:PD模型组LC3B-Ⅱ的表达水平与空白对照组或载体对照组相比明显降低;黄芩素+PD模型组较PD模型组LC3B-Ⅱ的表达水平明显增高;加入氯喹后,黄芩素+PD模型组比PD模型组LC3B-Ⅱ的表达水平更高。加入自噬抑制剂3-MA后检测发现,黄芩素诱导的细胞自噬被抑制后,Caspase-3的活性显著增高,线粒体膜电位进一步降低。(6)黄芩素对鱼藤酮在SH-SY5Y细胞系中诱导神经毒性的影响:与空白对照组或载体对照组相比,鱼藤酮组LC3B-Ⅱ蛋白表达、细胞活力、线粒体膜电位明显降低,培养上清中的LDH活性、caspase-3活性及Cleaved Caspase 3蛋白表达明显升高;而黄零素+鱼藤酮组与鱼藤酮组相比,LC3B-Ⅱ蛋白表达水平、细胞活力、线粒体膜电位明显增高,培养上清中的LDH活性、caspase-3活性及Cleaved Caspase 3蛋白表达则明显降低,加入氯喹后有黄芩素处理的SH-SY5Y细胞中LC3B-Ⅱ水平升高显著。加入自噬抑制剂3-MA或自噬诱导剂雷帕霉素进行自噬干预后,进一步研究发现,3-MA+黄芩素+鱼藤酮组与黄芩素+鱼藤酮组相比,LC3B-Ⅱ蛋白表达、细胞活力、线粒体膜电位又明显降低,培养上清中的LDH活性、caspase-3活性及Cleaved Caspase 3蛋白表达明显升高;雷帕霉素+鱼藤酮组与黄芩素+鱼藤酮组各项指标检测无明显差异。结论:(1)环境毒素鱼藤酮诱导PD模型能产生与人类PD行为学和生化特征相似的表现,可以用于评价PD治疗药物的神经保护作用。(2)体内、外试验结果说明黄芩素具有激活自噬,促进自噬流完成作用;黄芩素抑制鱼藤酮神经毒性,发挥抗凋亡、保护线粒体功能、增强细胞活力等保护作用与其诱导细胞自噬有一定关联。(3)自噬是PD的保护性分子通路,自噬调节治疗是有前景的PD治疗新途径。
【图文】：

精神萎靡，对刺激逃避反应慢等表现；黄芩素＋ＰＤ模型组相对ＰＤ模型组小鼠表逡逑现轻微。单纯黄芩素组、载体对照组与空白对照组一样，均未观察到明显异常行为。逡逑行为学检测结果如图１－１中所示，鱼藤酮诱发的ＰＤ模型组实验鼠僵直状态使得滚逡逑轴试验和网格试验中与空白对照组或载体对照组相比，掉落滚轴的时间及掉落网格的时逡逑间均明显缩短（ｐ＜０．００１），行为学观察及检测表现出类似人类ＰＤ行为学特征，说明ＰＤ逡逑模型构建成功。然而，黄芩素＋ＰＤ模型组与ＰＤ模型组比较有显著差异（ｐ＜０．０１），提示逡逑黄芩素治疗显著改善了这些由鱼藤酮毒素诱发的行为障碍。以上结果揭示黄芩素可以防逡逑止ＰＤ相关的由鱼藤酮引发的行为障碍。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑５0逦Ｒｏｔａｒｏｄ邋ｔｅｓｔ逦２５０逦Ｇｒｉｄ邋ｔｅｓｔ逡逑？逦￥逡逑４０逦４２．邋２００逡逑１３０＾逦｜邋｜逦（］邋＾逦Ｉ邋ｉ邋（］邋１逡逑ｉ：ＬｌＷｉ邋ｔｍｌＬ逡逑Ｖｅｈｉｃｌｅ逦？邋？邋？逦？逦？逦Ｖｅｈｉｃｌｅ逦？邋＋邋＿邋？逦？逡逑Ｒｏｔｅ邋ｎｏｎｅ逦？？＊？？＋逦Ｒｏｔｅ邋ｎｏｎｅ逦？邋？邋＋逦？逡逑ｂａｉｃａｌｅｉｎ逦？？？■？？＋逦ｂａｉｃａｌｅｉｎ逦？？？＊？？逦＋逡逑图ｌ－ｉ黄芩素逆转由鱼藤酮导致的行为障碍逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｂａｉｃａｌｅｉｎ邋ｒｅｖｅｒｓｅｓ邋ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ邋ｄｅｆｉｃｉｔｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｒｏｔｅｎｏｎｅ逡逑Ｃ５７ＢＬ鼠经鱼藤酮处理（５ｍｇ／ｋｇ６周）

逦－逦？逡逑图１－２黄芩素逆转由鱼藤酮导致的纹状体多巴胺含量减少逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｂａｉｃａｌｅｉｎ邋ｒｅｖｅｒｓｅｓ邋ｓｔｒｉａｔａｌ邋ｄｏｐａｍｉｎｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｒｅｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｒｏｔｅｎｏｎｅ逡逑Ｃ５７ＢＬ鼠经鱼藤酮处理（５ｍｇ／ｋｇ６周），继而加入黄芩素ｌＯＯｍｇ／ｋｇ共同治疗６周。纹状体ＤＡ逡逑含量由ＨＰＬＣ测定。数据以均数士标准差（ｘ土邋ＳＤ）表示。ｎ邋＝邋４．邋＊ｐ＜０．００１，与空白对照组或载体逡逑对照组相比；＃ｐ＜０．０１，，与ＰＤ模型组相比逡逑Ｃ５７ＢＬ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｒｏｔｅｎｏｎｅ邋（５ｍｇ／ｋｇ）邋ｆｏｒ邋６邋ｗｅｅｋｓ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ邋ｃｏ－ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｂａｉｃａｌｅｉｎ逡逑（ｌＯＯｍｇ／ｋｇ）邋ｆｏｒ邋ａｎｏｔｈｅｒ邋６邋ｗｅｅｋｓ．邋Ｄｏｐａｍｉｎｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒｉａｔｕｍ邋ｗａｓ邋ａｓｓｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ＨＰＬＣ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ．邋ｎ邋＝邋４．邋＊ｐ邋＜０．００１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｏｒ邋ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ，邋＃ｐ＜邋０．０１逡逑ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＤ邋ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑３黄芩素抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡逡逑通过检测Ｃａｓｐａｓｅ－３的活性和Ｃｌｅａｖｅｄ邋Ｃａｓｐａｓｅ邋３蛋白的表达，检验黄零素是否能减逡逑轻鱼藤酮诱导的细胞凋亡。结果发现
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2703244