风湿宁胶囊治疗类风湿关节炎的转录组测序研究

发布时间：2020-06-09 00:31

【摘要】：目的:本文应用i TRAQ蛋白组学和转录组学技术,从差异蛋白质和差异基因层面探讨风湿宁(以下简称FSN)胶囊治疗类风湿关节炎(RA)的作用机理,以期找到寒湿模型、CIA模型以及CIA+寒湿模型组(以下简称复合模型组)的相关差异蛋白和FSN胶囊作用后的差异基因,探讨寒湿因素对CIA模型的影响,以及FSN胶囊对于RA治疗的潜在作用,以期从病证结合角度研究FSN治疗R A的作用机制。方法:(1)建立寒湿证模型、CIA模型和复合模型,用i TRAQ/TMT(同位素标记相对和绝对定量)技术标记结合液相串联质谱蛋白组学整合生物信息学技术,鉴定寒湿、CIA、复合三模型大鼠血清的差异蛋白,对差异蛋白进行基因本体论(G ene Ontology)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes)功能的注释和富集分析,运用STRING蛋白相互作用数据库得到显著差异蛋白网络互做关系,筛选找到寒湿证与CIA模型相关的差异蛋白。(2)SPF级SD大鼠随机分为:正常组、CIA组、复合模型组、FSN低剂量组、FSN中剂量组、FSN高剂量组、Tofacitinib组、塞隆风湿组,每组12只。正常组和模型组用等量的生理盐水进行灌胃,其中各剂量组FSN每日1次,Tofaciti nib、塞隆风湿每日1次,均连续28天。造模28天后观察各组大鼠一般情况、大鼠关节肿胀度、HE染色观察大鼠关节病理学改变、酶联免疫吸附法(ELISA)同步检测大鼠外周血中RF、CRP以及IL-1β、IL-6、TNF-α等相关炎性细胞因子的水平,观察FSN胶囊对不同模型大鼠的治疗效果。(3)通过Illumina Hi Seq 4000平台对正常组、CIA模型组、复合模型组、FSNCIA给药组、FSN-复合给药组的5个大鼠滑膜组织样品进行转录组测序分析,并对差异表达基因进行GO分析以及pathway通路分析,筛选找到FSN治疗RA的关键差异表达基因。结果:(1)通过比较分析法应用i TRAQ质谱结合生物信息学技术确证组织中特征性的差异表达蛋白谱。对于样本两两间的比较,本实验以上调或下调1.3倍,即组间表达差异1.3(上调)或0.77(下调),且P0.05为显著差异标准,筛选的蛋白作为差异表达蛋白。i TRAQ试剂标记四组血清(正常对照组、CIA模型组、寒湿模型组、复合模型组)液质联用鉴定分析出435933个质谱,肽段2230个,差异蛋白点540个,其中518个蛋白有定量值。寒湿模型组与对照组鉴定得到差异蛋白125个,寒湿组中上调86个,下调39个;CIA模型组与对照组差异蛋白93个,CIA组中上调27个,下调66个;复合模型组与对照组差异蛋白190个,复合组中上调152个,下调38个;复合模型组与寒湿模型组差异蛋白217个,上调140个,下调77个;复合组和CIA组差异蛋白245个,上调208个,下调37个。差异性表达蛋白的生物信息学方面,与RA发生相关的主要涉及炎症反应、免疫反应、细胞结构蛋白、信号转导等方面的功能。所涉及的通路与RA相关的主要有补体系统、凝血系统的激活。寒湿因素对CIA模型血清蛋白影响关系较紧密的差异蛋白有HSP90AA1、ALDOA、PKM、RAC1、VWF、C2、HSP90B1、HSPD1、PSMA3、PSMA6、PSMA4、PSMA2等,在蛋白网络互联及相关通路中起关键作用,是RA发生的关键节点。(2)从大鼠的整体状况上看:CIA模型组、复合模型组大鼠关节出现红肿,饮水及摄食量降低,嗜睡,精神萎靡,皮毛枯燥无光泽,行动迟缓,大便稀溏。与正常组相比滑膜增生、形成血管翳、软骨和骨组织受到浸润亦伴发新生;关节红肿、肿胀度显著升高;类风湿因子、C反应蛋白水平以及与炎症相关的炎性细胞因子水平明显升高。与CIA模型组相比较,复合模型组滑膜增生及关节红肿、肿胀度显著升高;炎性细胞因子水平明显升高;FSN胶囊药物治疗组与模型组相比精神状况有好转,进食量增加,行动力改善,大便稀溏状况改善,关节红肿减轻;FSN胶囊给药组在28天后,各给药组大鼠精神状况有不同程度好转,饮水及摄食量增加,大鼠关节肿胀度明显低于模型组,行动缓慢等症状明显改观;在关节病理方面,FSN药物治疗组可以减轻滑膜细胞增生,炎性细胞浸润可见不同程度减少,关节病理特征得到改善,治疗组大鼠外周血中RF、CRP以及炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平也明显降低。(3)本研究采用Illumina Hi Seq 4000对FSN胶囊干预前后的CIA和复合模型的大鼠滑膜组织5个样品进行转录组测序,每个样品平均产出4.48 Gb数据,最终一共检测出9070个新转录本,其中4084个属于已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型,2600个属于新的蛋白编码基因的转录本,剩下的2386个属于长链非编码RNA。CIA模型给药组与复合模型给药组、正常组与复合模型给药组、复合模型组与复合模型给药组、CIA模型组与复合模型组、正常组与CIA模型给药组、正常组与CIA模型组、正常组与复合模型组、CIA组与CIA模型给药组差异表达基因分别是278个、118个、84个、65个、56个、37个、4个、3个。其中复合模型组与复合模型给药组、CIA模型组与复合模型组和CIA组与CIA模型给药组差异表达基因分别上调54个、1个、65个,以及下调30个、2个和0个。对差异表达基因进行GO分析和pathway分析,GO富集分析表明,大部分差异表达的基因富集在细胞进程、发育、代谢、免疫、生物进程调节、刺激应答、细胞信号、细胞组分、胞外区域、催化活性、结合活性等。Pathway通路分析结果表明,大部分差异表达的基因富集在细胞群落、运输和分解代谢、蛋白折叠与降解脂代谢、免疫疾病等。FSN治疗RA相关的基因有:FDFT1、SQLE、AKAP13、KCNMB1、UBB、RPS27A等。结论:(1)本研究首次懫用i TRAQ/TMT标记结合液相串联质谱蛋白组学技术对三模型大鼠的差异表达蛋白进行了初步鉴定,鉴定得到的差异表达蛋白可能在寒湿因素对CIA模型的影响中起了重要作用。(2)FSN胶囊可明显改善类风湿性关节炎大鼠模型组的相关生理指标:IL-1β、IL-6、TNF-α、RF和CRP等。(3)本研究首次应用转录组测序技术对FSN胶囊干预前后的大鼠滑膜组织的差异表达基因进行鉴定,鉴定得到的差异表达基因可能是FSN胶囊治疗RA的关键作用靶点。
【图文】：

流程图,分析流程,蛋白质组学,阈值

iTRAQ/TMT定量蛋白质组学信息分析部分操作流程

长度分布,血清蛋白,丰度,长度分布

图 1-1 血清蛋白除高丰度前后的 SDS-PAGE 据的质量控制定到肽段的长度分布长度分布情况进行统计分析（如图 1-3 所示段的比例，以横坐标代表肽段氨基酸残基符合基于 trypsin 酶解和 HCD 碎裂方式的布符合质控要求。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】