黄芩苷体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

发布时间：2020-06-10 20:36

【摘要】：目的:对人脐带中间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)进行分离培养和鉴定分析,采用黄芩苷定向诱导,观察其对hUMSCs的影响和效用,初步探讨黄芩苷诱导hUMSCs向神经细胞诱导分化的作用、条件及作用机制。方法:收集的新鲜脐带来自于手术室足月剖宫产的健康产妇,用D-Hank’s液冲洗,去除脐带动脉和静脉后,使用消毒器皿对其进行剪切,形成大小约为1mm~3的组织块,然后采用浓度为0.2%的胶原酶Ⅱ进行消化。之后置入DMEM/F12培养液中培养,培养液中加用主要药物有:左旋谷氨酰胺(L-Glu,25 mM)、20%胎牛血清(FBS)、表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)2ng/ml,同时,加入链霉素100μg/ml、青霉素100U/ml预防感染。观察并详细记录所提取原代细胞的生长情况,当细胞生长到融合率大约达80%密度时,加入0.25%胰酶-1mM EDTA进行消化和传代。消化完成后,采取流式细胞术对首次消化后收集的细胞表型进行检测,这些细胞表型包括:CD45、CD90、CD34、CD105、CD11b、CD19、CD73以及组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II),采用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作为同型对照。原代hUMSCs按比例1:1传代,传代后的细胞记作P1代,倒置显微镜下观察增殖速度及细胞形态变化,细胞融合度达到90%以上时,按1:2或1:3比例传代,绘制细胞生长曲线。选取培养P4代的hUMSCs为研究对象,根据给药情况分为四组:25μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组和对照组。采用事先准备的以多聚赖氨酸包被的六孔板,按3×10~4/孔的密度将P4代细胞接种于4个六孔板中(每个六孔板为一组),待细胞生长达70%融合度时,实验组的三个六孔板分别更换为含25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml黄芩苷的低糖无血清DMEM/F12培养基进行神经诱导;对照组为不含黄芩苷的相同培养基。于倒置显微镜下动态观察细胞形态变化,每12小时观察一次,连续观察7天。对各组细胞每24h进行一次免疫细胞化学染色,检测诱导细胞中神经干细胞标记---Nestin、星形胶质细胞标记---胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元标记---神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的表达情况。各组随机选取10个高倍视野,拍照并计数细胞总数及阳性细胞数,用以计算分化率,结果用均数±标准差来表示。结果:原代细胞经过消化、传代,培养12h时,我们发现,大部分细胞呈贴壁生长,细胞形态可为三角形、椭圆形、菱形或圆点状;随着培养时间的递增,细胞形态逐渐衍生为梭形;培养7-8d后细胞倍增达85%以上融合度时,低倍镜下可观察到hUMSCs呈放射状或漩涡状排列。随后按1:2的比例进行传代,发现P15代的hUMSCs仍能呈现旺盛的生长增殖能力。对P2、P5和P8细胞,细胞表面标记物流式细胞术检测结果显示:CD90、CD105和CD73均阳性表达,CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR均不表达。加入不同浓度黄芩苷诱导液24h后,100μg/ml组显微镜下可以看到个别细胞出现了形态改变:胞体收缩,细胞变圆,折光度增加;而50μg/ml组和25μg/ml组六孔板内细胞未见明显形态学改变;随着诱导时间的逐渐延长,发生形态改变的细胞胞体进一步收缩;48h后部分细胞伸出指状突起;72h后100μg/ml组可见细胞突起增长并形成双极样突触,50μg/ml组也开始出现折光度增强的类似改变,而25μg/ml组细胞形态始终未见明显改变;诱导96h时,100μg/ml组形态改变的细胞突起较前更加细长,并可多达2至5条,折光度进一步增强,呈典型神经样细胞改变;50μg/ml组细胞也开始形成突触样类神经细胞,25μg/ml组细胞形态依然未见明显变化;诱导120h时,100μg/ml组神经样细胞数量明显增多,50μg/ml组内变化呈类似趋势,6d后100μg/ml组、50μg/ml组形态变化细胞数未见继续增多,25μg/ml组仅出现折光度增强细胞,7d时100μg/ml组、50μg/ml组神经样变化的细胞可见漂浮死亡现象,神经样细胞比例下降,25μg/ml组仅出现少量带突起神经样细胞。免疫细胞化学染色可见神经样细胞阳性表达Nestin、GFAP和NSE。在不同药物浓度作用下,各标志物阳性表达率随时间的变化依次为:100μg/ml组(0.0±0.0、1.9±0.9、8.5±0.6、11.0±0.5、16.4±0.5、16.3±0.6、11.5±0.6);50μg/ml组(0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、2.1±0.2、6.7±0.7、10.1±0.4、8.1±0.5);25μg/ml(0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0)。对照组免疫细胞化学呈阴性。结论:1.从人脐带分离得到的hUMSCs表达间充质干细胞标志物CD73、CD90和CD105,而不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45、CD19、CD11b和组织相容性抗原HLA-DA(MHC-Ⅱ)。具有干细胞特性。可作为神经系统干细胞移植的细胞来源。2.从人脐带中分离纯化得到的hUMSCs可在体外稳定传代,并保持较高活性。3.黄芩苷在一定浓度下可体外诱导hUMSCs分化成神经样细胞,并表达神经元表面标志物NSE和神经胶质细胞标志物GFAP以及神经干细胞标志物Nestin。
【图文】：

人脐带,间充质干细胞,倒置显微镜

图 1 在倒置显微镜下观察的原代人脐带间充质干细胞（x40）Fig.1 Photographs of the original culture of hUMSCs were observed under aninverted microscope. Zoom in: 40 XNote:A. After 12 hours of cultivation, hUMSCs showed diamond, triangle,oval, dot and other forms.B. After 3 days of cultivation, the long axis is one.C.After 7 days of culture, hUMSCs had fused about 90 % and arranged radially

间充质干细胞,组培,脐带

图 2 5 天后在显微镜下观察不同浓度组培养的人脐带间充质干细胞（x200）Fig.2 hUMSCs of different dosage groups was observed by reversemicroscope on the 5th day after differentiation culture. Zoom in: 200 XNote:A. 100μg/ml group; B. 50μg/ml group; C. 25μg/ml group; D. 0μg/ml-control group
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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