益气温阳通络法预防糖尿病大鼠视网膜病变发生的作用及机制研究

发布时间：2020-06-11 05:37

【摘要】：糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最为常见和严重的微血管并发症之一,早期预防可降低糖尿病致死、致残率,减轻国家巨大的医疗负担。目前DR的发病机制尚不明确,表观遗传调控成为近年来的研究热点。持续高糖状态下引起的表观遗传修饰的变化,在DR的发病中起重要作用,早期对其修饰的相关靶点进行药物干预对于逆转DR的发病进程十分关键。“早期治络、全程通络”是课题组预防糖尿病血管并发症的原创性理论,基于此,在DR的预防中主要使用益气温阳通络法,临床己有多年临床积累,益气温阳通络方根据益气温阳、活血化瘀通络的原则组方而成。前期研究表明,本方可调节视网膜缺血缺氧状态,改善视网膜血管微循环,但具体作用机制尚不十分明确,值得进一步研究。研究目的:(1)探讨在糖尿病大鼠视网膜病变发生前预防性给予益气温阳通络方,是否可以延缓糖尿病大鼠DR的发生,改善血管内皮功能。(2)探讨益气温阳通络方是否可以通过降低伊文思蓝渗漏量,上调紧密连接蛋白的表达,从而降低视网膜血管通透性,保护血——视网膜屏障。(3)探讨益气温阳通络方是否可以通过上调microRNA-200b,下调VEGF与PEDF比值,以及上调Ang-1、Tie-2等关键靶基因的表达,从而改善视网膜内皮功能障碍,预防DR发生。(4)探讨益气温阳通络方是否可以通过上调microRNA-146a,调控NF-κB和P38-MAPK通路,下调ICAM-1、TNF-α的表达,抑制炎症状态,预防DR发生。(5)探讨益气温阳通络方是否可以改善胰腺病理损害、增加胰岛素表达、减少胰高血糖素表达,改善IRS-1的表达,从而延缓DR发生和发展。研究方法:(1)雄性SD大鼠160只,随机分为正常对照组(n=40)、糖尿病模型组(n=40)、中药组(n=40)、西药组(n=40)。各组DM模型大鼠通过一次性腹腔注射链脲佐菌素(2%的STZ,60mg/kg)建立DM模型。中药组、西药组于造模成功次日分别以等效剂量的益气温阳通络方(42ml/kg·d)、羟苯磺酸钙(104mg/kg·d)灌胃治疗,正常组、模型组大鼠灌胃正常蒸馏水,于0、4、8、12、16、20、24周分别检测各组大鼠体重及随机血糖,于病程12或24周处死大鼠,并取材用于相关实验。采用苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠视网膜组织病理学改变;采用视网膜血管消化铺片和过碘酸希夫染色(PAS)染色观察各组大鼠视网膜毛细血管的病理学改变。另外,采用雄性SD大鼠和BN大鼠各6只,随机分为正常对照组(n=6)、DM模型组(n=6),使用Micron-III视网膜影像系统进行眼底观察和荧光造影检查,观察各组大鼠DR的病理表现。(2)采用伊文思蓝(EB)灌注观察DR大鼠视网膜血管渗漏情况;采用免疫组化染色法、Western blot、RT-PCR 法分别检测各组大鼠 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5的表达。(3)采用TUNEL法检测各组大鼠视网膜内皮细胞凋亡情况;免疫组化染色法检测VEGF、PEDF、Tie-2、ICAM-1在视网膜的表达;Western blot检测VEGF、VEGFR、PEDF、Ang-1、Tie-2、TNF-a、ICAM-1、NF-κB、p38-MAPK蛋白的表达量;RT-PCR 法检测 VEGF、p38-MAPK、miR-200b、miR-146a 基因的表达。(4)采用HE染色观察各组大鼠胰腺组织病理学改变;采用免疫组化染色法检测胰岛素、胰高血糖素在胰腺的表达;Western blot检测IRS-1蛋白在胰腺的表达。研究结果:1.对一般状态、体重、血糖及视网膜病理的影响:(1)成模后4周开始,DM大鼠的体重与正常组相比明显减轻,差异有显著统计学意义(P0.05)。中药组和西药组大鼠体重与DM模型组相比明显增加,差异有显著统计学意义(P0.05)。与正常组相比,DM组大鼠各时间点随机血糖显著升高(P0.05);而DM模型组、中药组、西药组大鼠随机血糖无显著差异(P0.05)。DM大鼠发病12周后晶状体浑浊情况:双侧混浊率(96%),无混浊率(4%);正常组大鼠晶状体无混浊现象。(2)DM3月视网膜HE染色:正常组大鼠视网膜各层结构清晰;DM模型组视网膜组织轻微水肿,各层细胞界限模糊,节细胞减少;中药组和西药组视网膜各层排列较整齐,有轻微组织水肿,未见毛细血管扩张。DM6月视网膜HE染色:DM模型组的视网膜各层结构不清晰,节细胞减少,有空泡形成;内核层细胞明显排列紊乱,周围水肿更明显,毛细血管明显扩张。中药组和西药组视网膜轻微水肿,细胞排列紊乱,可见内皮细胞增生。(3)DM3月视网膜消化铺片:正常组毛细血管分布规则,走向较直,血管径粗细均匀;DM模型组毛细血管网排列紊乱,基底膜部分略增厚,周细胞减少,内皮细胞开始增生;中药组及西药组血管铺片表现接近正常组,毛细血管分布较规则,周细胞、内皮细胞分布排列基本规律。DM6月视网膜消化铺片:DM模型组毛细血管分布紊乱,有扭曲聚集等现象,部分毛细血管扩张,并可见微血管瘤、影周细胞、无细胞毛细血管散在分布。中药组的视网膜毛细血管得到明显的保护,未见扭曲聚集现象,毛细血管轻微扩张,内皮细胞、周细胞分布排列比较规律;西药组对视网膜的保护作用不如中药组。(4)眼底照相和血管荧光造影提示:SD大鼠受到迅速的涡静脉和脉络膜血管的背景荧光干扰,视网膜血管显影不清晰;正常BN组大鼠毛细血管清晰;而DM6周的BN大鼠,血管荧光造影均出现静脉迂曲、微动脉瘤、荧光素渗漏等病理表现。2.对血——视网膜屏障保护的影响:(1)DM3月的模型组SD大鼠伊文思蓝(EB)渗漏量与正常组比明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05);中药组和西药组的EB渗漏量明显降低,与正常组比差异具有显著统计学意义(P0.05)。(2)DM模型组大鼠视网膜ZO-1、Occludin以及Claudin-5的表达量较正常组明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与DM模型组相比,中药组视网膜组织ZO-1表达量明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05),而西药组ZO-1表达有升高趋势,但无显著性差异(P0.05);中药组和西药组视网膜组织Occludin表达明显升高,差异有显著统计学意义(P0.05);西药组视网膜组织Claudin-5表达量明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05),而中药组Claudin-5表达有升高趋势,但无显著性差异(P0.05)。3.对改善血管内皮功能的作用机理:(1)TUNEL检测显示DM模型组大鼠凋亡的视网膜细胞比正常组明显增加,差异具有统计学意义(P0.05);中药组和西药组大鼠视网膜细胞凋亡细胞较DM组明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)DM模型组视网膜VEGF和VEGFR表达量与正常组相比明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05);与DM模型组相比,中药组与西药组VEGF表达量明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05);与DM模型组相比,中药组和西药组VEGFR表达量均有降低趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。(3)DM模型组视网膜组织PEDF表达量与正常组比明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05);中药组视网膜PEDF表达量比DM模型组明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05);西药组PEDF表达量比模型组有上升趋势,但无显著统计学差异(P0.05)。(4)与正常组比较,DM模型组Ang-1和Tie-2表达明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05);与DM模型组比较,中药组Ang-1和Tie-2表达与模型组比明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05);西药组Ang-1和Tie-2表达有上升趋势,但无显著统计学差异(P0.05)。(5)与正常组比较,DM模型组miR-200b的表达量与正常组比明显降低,差异有显著统计学意义(P0.05);中药组和西药组miR-200b相对表达量较DM模型组明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05)。4.对缓解炎症状态的作用机理:(1)DM模型组视网膜组织TNF-α和NF-κB的表达与正常组比明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05);中药组和西药组NF-κB表达比模型组明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05)。中药组和西药组TNF-α表达与模型组比有降低趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。(2)与正常组比较,DM模型组的ICAM-1表达明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05)。与DM模型组比较,中药组和西药组ICAM-1表达明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05)。(3)与正常组比较,DM模型组p38-MAPK表达量与正常组比明显升高,差异具有显著统计学意义(P0.05);与DM模型组相比,中药组和西药组p38-MAPK表达量明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05)。(4)DM模型组microRNA-146a的表达量与正常组比明显降低,差异具有显著统计学意义(P0.05);中药组与西药组的miR-146a的相对表达量较DM模型组有升高趋势,但无显著统计学差异(P0.05)。5.对胰腺病理的影响:(1)DM3月胰腺HE染色:正常组大鼠胰岛形态规则,为圆形或卵圆形的细胞团,胰岛细胞数量较多,与外分泌腺界限清楚;DM模型组胰岛形状不规则,胰岛细胞数量减少、分布稀疏;中药组和西药组:胰岛形状欠规则,胰岛细胞数量减少,与外分泌腺界限相对清楚。DM6月胰腺HE染色:DM模型组胰岛严重萎缩,胰岛细胞数量严重减少、分布稀疏,外分泌腺向胰岛内入侵,胰岛细胞肿胀,部分细胞核固缩、分裂。中药组和西药组胰岛形状欠规则,胰岛萎缩,胰岛细胞数量减少。(2)免疫组化结果显示:与正常组比较,DM模型组大鼠胰岛素染色阳性β细胞数量明显降低(P0.05),胰高血糖素染色阳性α细胞数量明显升高(P0.05);与模型组比较,中药组能显著升高胰岛素染色阳性β细胞数量,降低胰高血糖素染色阳性α细胞数量(P0.05)。(3)DM模型组大鼠胰腺IRS-1的表达量较正常组明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组相比,中药组和西药组的IRS-1表达有升高趋势,但无显著性差异(P0.05)。研究结论:1.链脲佐菌素诱导的SD大鼠糖尿病病程达12周时,大鼠视网膜出现早期DR的病理改变;随着糖尿病病程延长,视网膜病理改变逐渐加重。2.糖尿病大鼠视网膜病变发生前预防性给予益气温阳通络方,可缓解大鼠DR的病理表现,减少伊文思蓝渗漏量,从而保护血—视网膜屏障,机制与增加紧密连接蛋白Occludin与ZO-1表达有关。3.益气温阳通络方预防DR的机制可能通过调控miR-200b的表达,抑制VEGF表达,上调PEDF、Ang-1、Tie-2等关键靶基因的表达,从而改善视网膜内皮功能障碍,预防DR的发生。4.益气温阳通络方还可能通过调控NF-κB和p38-MAPK通路,降低ICAM-1的表达,同时降低TNF-α表达的趋势,抑制炎症状态,预防DR的发生。5.益气温阳通络方可改善胰腺病理形态,显著增加胰岛素阳性表达,减少胰高血糖素阳性表达,可能具有保护胰岛功能的趋势。
【图文】：

Ｋka逡逑ｉ秦：满逡逑图２－２：邋ＮＰＤＲ的病理特征：主要症状是视网膜微动脉瘤，出血，和硬性渗出（Ａ和Ｂ）：和视网膜血逡逑管异常（Ｃ：箭头）；静脉串珠（Ｄ：箭头）；静脉环的形成（Ｅ：箭头）。（引自：ＣｈｅｕｎｇＮ，邋ＭｉｔｃｈｅｌｌＰ．邋Ｗｏｎｇ逡逑ＴＹ．邋Ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．邋Ｌａｎｃｅｔ邋２０１０；邋３７６：１２４－３６．）逡逑＿＿逡逑欵ｉ逡逑图２－３：邋ＰＤＲ的病理特征：ＰＤＲ的重要标志——新生血管形成（Ａ：箭头），可通过眼底视网膜血管造逡逑２８逡逑

ＴＹ．邋Ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．邋Ｌａｎｃｅｔ邋２０１０；邋３７６：１２４－３６．）逡逑＿＿逡逑欵ｉ逡逑图２－３：邋ＰＤＲ的病理特征：ＰＤＲ的重要标志——新生血管形成（Ａ：箭头），可通过眼底视网膜血管造逡逑２８逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2707451