含何首乌制剂致药物性肝损伤患者TCR免疫组库特征研究

发布时间：2020-06-12 14:55

【摘要】：研究背景:近年来,关于服用含何首乌制剂后出现药物性肝损伤的报道增多,也引起了部分药学领域专家的的关注,据文献报道,关于何首乌毒性的动物试验研究发现,何首乌毒性反应与临床报道不同,因此,有关肝病专家考虑服用含何首乌制剂出现药物性肝损伤,其根本原因在于个体差异。因其发病率低,不易被检测到,且与药物使用剂量无明显联系,考虑含何首乌制剂致药物性肝损伤类型属于特异质肝损伤型。关于特异质肝损伤发生机制,目前主要有两方面假说,一类是化学药物诱导的特异质肝损伤免疫学机制假说,包括免疫药理(p-i)假说、基因多态性假说、半抗原假说等,一类是中药免疫应激“三因致毒”假说。中药免疫应激“三因致毒”假说重点在于中药“无毒”理论,有研究通过构建低剂量LPS模型,证明何首乌的特异质肝损伤属性,并且发现何首乌诱导的特异质肝损伤是机体免疫功能异常、何首乌中免疫活性成分(反式二苯乙烯苷,trans-SG)、潜在肝损伤易感成分(顺式二苯乙烯苷,cis-SG)三者协同作用的结果,而在三者中,机体免疫功能异常是导致肝损伤的基础,因此本研究落脚于获得机体免疫特征。研究目的:通过分析服用含何首乌制剂后出现肝损伤与未出现肝损伤患者外周血TCR免疫组库特征,发现服用含何首乌制剂易出现肝损伤患者的免疫组库特征,为筛选对何首乌致肝损伤的高敏人群,降低服用含何首乌制剂后出现不良反应发生提供参考。资料与方法:1、本研究基于“重大新药创制”国家科技重大专项课题参与单位收集的服用何首乌及其制剂后出现药物性肝损伤患者,填写数据采集表并采集血样。使用巢式病例对照方法,对纳入服用含何首乌制剂出现肝损伤患者年龄±5岁,性别相同,基础疾病相近,口服主要成分包括何首乌的制剂且没有表现出肝脏受损的病患,使用1:1的比例进行匹配。共纳入患者92例。在数据采集过程中主要应用巢式病例对照设计:巢式病例对照设计结合了队列研究与对照设计的优势,在临床试验中常用于罕见病研究,药物性肝损伤是小概率发生事件,因此本试验可应用此方法;样品检测应用免疫组库测序方法:免疫组库是在特定时间内,人体免疫系统中T细胞或B细胞的总和,研究免疫组库特征就需要测定免疫系统中TCR序列及基因信息,本方法通过PCR扩增技术,获得T细胞多样性的互补决定区,再通过第二代高通量测序技术,在宏观上评估免疫系统的多样性,深入挖掘免疫组库与特异质肝损伤发生的关系。样品检测由华大基因公司进行,主要包括淋巴细胞提取、文库的构建、文库的质量检测以及测序,样品检测主要检测样品浓度和完整性,荧光定量主要对样品浓度进行精确定量,琼脂糖凝胶电泳使用1%浓度的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳约40min,主要是检测样品完整性。,文库构建选用QIAGEN试剂盒进行多重PCR反应,使用Agilent 2100 Bioanalyzer技术检测文库的片段范围,并使用ABI Step One Plus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)技术对文库进行浓度的定量。检测合格的文库,加入NaOH变性成单链,按照预期上机密度,将变性稀释后的文库加入到FlowCell内,和FlowCell上的接头相互接触,再通过簇生成平台cBot完成桥式PCR扩充,然后在IlluminaHiSeq2000平台上完成测序。应用VDJtools软件做比对后的分析,基本统计分析、克隆多样性评估、样本间克隆重叠,样本间克隆群体相似度等分析模块结果:1、一般资料结果:共纳入患者92例,男女比例为1:1,所有患者的年龄均在38-85岁之间,平均年龄是64.45岁,中位数是63岁。对所有患者涉及的基础疾病进行统计,观察组按出现频次排前5位的分别是高血压、冠心病、高血脂、糖尿病及腔隙性脑梗塞;对照组患者按出现频次排前5位的分别是高血压、冠心病、心律失常、2型糖尿病和腔隙性脑梗死;对纳入患者服用含何首乌制剂治疗的疾病进行统计,观察组患者服用含何首乌制剂治疗的疾病按频次排前3位的是冠心病,高血压和高血脂,对照组患者服用含何首乌制剂治疗的疾病按频次排前3位的是冠心病、高血压和心律失常;对使用含何首乌制剂中何首乌类型进行统计,其中其中怀疑用药制首乌为86例,均为中成药;不明首乌类型为6例,均为中药汤剂。2、免疫组库结果(1)观察组在CDR3数量及克隆种类上明显高于对照组,且有统计学差异。而测序深度差别不大;(2)分析所CDR3区氨基酸序列长度,发现长度为17,20,46,62,63处存在统计学差异;(3)分析V基因丰度,发现TRBV13,TRBV29,TRBV5-5,TRBV6-8丰度在两组间存在统计学差异;(4)分析J基因丰度,发现TRBJ2-4,TRBJ2-5丰度在两组间存在统计学差异;(5)分析两组之间同一对v-j基因组合统计学差异,TRBV13,TRBV29,TRBV5-5,TRBV6-8与TRBJ2-4,TRBJ2-5基因重组存在差异;(6)通过 clone number,resampled diversity,extrapolate_diversity,chaoE,chaol,shannon Wiener Index,inverse Simpson Index共7种指标反映样本的多样性结果,可以得出,除shannon Wiener Index和inverse Simpson Index外,其余各指标均显示两组观察组多样性高于对照组,且有统计学差异,其中,chaol指标更显示有明显统计学差异。结论:(1)观察组CDR3序列多样性高于对照组且存在统计学差异。提示特异质肝脏受损的发病及恶化和免疫组库的多样性具有紧密联系。(2)通过比较发现出现肝损伤患者外周血TCR CDR3免疫组库中存在多对V-J基因重组有差异性,且差异主要体现在TRBJ2-4与TRBJ2-5基因上面,提示TRBJ2-4与TRBJ2-5重组异常影响抗原受体。
【图文】：

图１药物性肝损伤诊断流程图逡逑３、样品采集、检测及数据分析逡逑

含何首乌制剂致药物性肝损伤患者TCR免疫组库特征研究

图２淋巴细胞分离示意图逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.6

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