艾叶挥发油及其类脂囊泡抗肺癌作用研究

发布时间：2020-06-13 15:27

【摘要】：艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥叶~([1])。艾叶挥发油(Artemisia argyi essential oil,AAEO)是艾叶的主要有效成分群之一,具有抗菌、抗炎、镇咳平喘等作用~([2,3])。本课题组前期研究发现,AAEO还具有抗乙肝病毒和抗肝癌活性。预实验研究发现,AAEO对肺癌A549细胞增殖具有显著的抑制作用。本课题将进一步研究AAEO体外抗肺癌活性,并初步探讨其作用机制。制备AAEO类脂囊泡并进行评价,研究AAEO及其类脂囊泡体内抗肺癌活性和药代动力学。实验内容包括以下四方面:1.AAEO体外抗肺癌A549细胞活性及初步机制采用MTT法检测AAEO对A549细胞增殖的影响。结果显示:AAEO浓度为660.8μg/mL时,48和72 h细胞增殖抑制率分别为85.75%和88.37%。AAEO浓度由188.8μg/mL增至660.8μg/mL,72 h细胞增殖抑制率由37.25%增至88.37%。24、48和72 h IC_(50)值分别为513.54μg/mL、495.60μg/mL和484.27μg/mL。表明AAEO能显著抑制体外培养的人肺癌A549细胞增殖,且具有时间和浓度的依赖性(P0.05)。Annerxin V-FITC/PI双染法检测经不同浓度AAEO处理后的A549细胞凋亡情况。AAEO浓度为188.8μg/mL和424.8μg/mL时,48 h细胞凋亡率分别为4.8%和67.1%。说明AAEO可诱导A549细胞凋亡,并具有明显的浓度依赖性(P0.05)。PI单染法检测细胞周期分布变化。AAEO作用A549细胞48 h,浓度由0增至330.4μg/mL,G_0/G_1期细胞比例由67.73%降至52.10%,S期细胞比例由26.83%增至40.47%,G_2/M期无明显变化。由此可知,AAEO可阻滞细胞周期于S期。推测与抑制细胞DNA合成有关。2.AAEO类脂囊泡的制备与评价GC法建立AAEO类脂囊泡多成分含量测定方法,并进行方法学考察。采用薄膜分散-超声法制备AAEO类脂囊泡。通过单因素考察及Box-Behnken响应面设计优化,得到最优处方及制备工艺参数为:非离子型表面活性剂HLB值为4.88,AAEO加入量为0.141 g,水合温度为68℃,水合时间和超声时间分别为30 min和10 min。在此条件下,制备的AAEO类脂囊泡包封率大于80%。AAEO类脂囊泡自然光下为乳白色混悬液,扫描电镜结果显示其为具有双分子层结构的均匀球形。平均粒径为407.54±11.37 nm,PDI为0.114±0.006,平均电位为-47.0±0.72 mV。AAEO类脂囊泡中桉油精、樟脑和龙脑的平均包封率分别为82.32%、82.64%和88.32%,平均载药量分别为5.26%、1.11%和1.13%。体外释药结果表明,12 h时,AAEO及其类脂囊泡累积释放量分别为76.18%和66.07%,AAEO类脂囊泡释放速率慢。药物稳定性实验结果表明:AAEO类脂囊泡在强光与高湿条件下较为稳定,高温对其影响明显。4℃放置90天,较为稳定,25℃放置30天,包封率由89.25%降至71.47%,90天时降至49.25%。提示AAEO类脂囊泡应于4℃存放。3.AAEO及其类脂囊泡体内抗肺癌药效学通过对裸鼠皮下注射A549细胞建立肺癌模型。随机分为8组给药:阴性对照组,高、中、低AAEO组,高、中、低AAEO类脂囊泡组,阳性对照组(5-Fu组)。连续给药15天,5-Fu组肿瘤生长抑制率为71.10%,AAEO及其类脂囊泡高剂量组抑瘤率分别为55.54%和58.76%。随着给药时间的延长,5-Fu组裸鼠出现食欲减退、体重下降等毒副反应,体重由19.33g降至16.35g。AAEO及其类脂囊泡组裸鼠体重无明显变化。4.AAEO及其类脂囊泡体内药代动力学AAEO及其类脂囊泡大鼠灌胃,分组给药,两组所含AAEO的量相同。AAEO组血药浓度达峰时间为1.5 h,浓度为10.0913μg/mL;AAEO类脂囊泡组血药浓度达峰时间为3 h,浓度为10.9533μg/mL。AAEO制成类脂囊泡后,半衰期由3.155 h增至3.993 h,血浆中AAEO的量提高1.29倍。表明AAEO类脂囊泡具有缓释作用,且可提高AAEO的生物利用度。综上所述,AAEO及其类脂囊泡具有明显的抗肺癌活性。推测与抑制细胞周期的正常转换,阻滞细胞于S期,抑制DNA合成有关。将AAEO包裹在类脂囊泡中,可改善因AAEO难溶于水,挥发性强使其成药困难的问题,同时可提高AAEO的生物利用度。为AAEO抗肺癌新药研究提供了科学依据。创新点:首次进行了AAEO抗肺癌活性研究。为解决AAEO难溶于水、挥发性强的问题,首次研制了AAEO类脂囊泡,并对其体内抗肺癌活性和药代动力学进行研究。
【图文】：

抑制率,浓度,浓度依赖性

b:48h，c:72h图 1.1 系列浓度 AAEO 对 A549 细胞增殖抑制率（n=3）Fig.1.1 The proliferation inhibition rates ofA549 cells treated with AAEO注：与 5-Fu 组比较，**P<0.01。表 1.1 和图 1.1 可以看出，浓度为 472.0 μg/mL 的 AAEO 作用 A54 72 h，，细胞增殖抑制率与 5-Fu 组抑制率相当。AAEO 浓度为 660.8 和72 h 细胞增殖抑制率分别为85.75%和 88.37%，均大于 80%。说明抑制 A549 细胞的增殖。24、48 和 72 h IC50值分别为 513.54 μg/mL、L 和 484.27 μg/mL。细胞增殖抑制率随 AAEO 浓度的增加和作用时加，说明抑制作用具有时间和浓度依赖性（P<0.05）。Annerxin V-FITC /PI 双染法检测细胞凋亡情况系列浓度 AAEO 作用 A549 细胞 48 h，细胞凋亡情况如图 1.2 所示

变化曲线,浓度,变化曲线,细胞

第一章 AAEO 体外抗肺癌 A549 细胞活性及初步机制图 1.2 中 B1、B2 区域蓝色荧光分别代表坏死细胞和晚凋细胞，B3 区域荧光代表正常细胞，B4 区域红色荧光代表早凋细胞。从图中可以看出，随EO 浓度变化，各区域细胞占比发生明显改变。早凋细胞占比随 AAEO 浓高而增大。表 1.2 数据表明：AAEO 浓度由 0 增至 424.8μg/mL，早期凋亡 1.97%增至 59.57%，说明细胞早期凋亡率与 AAEO 浓度呈正相关。AAEO为 330.4μg/mL 时，晚期凋亡率与坏死率出现最大值，分别为 10.9%和 8.1
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

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