雷公藤甲素对H9c2心肌细胞缺氧再灌注损伤保护作用的研究

发布时间：2020-06-13 20:23

【摘要】：目的:本研究旨在观察经缺氧再灌注处理的H9c2心肌细胞上清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH),丙二醛(malondialdehyde,MDA),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量的变化,倒置荧光显微镜下细胞内活性氧的释放(reactive oxygen species,ROS),并检测H9c2心肌细胞增值率、存活率和细胞形态学的改变,探究ROS、MDA、SOD等对H9c2心肌细胞再灌注损伤的作用;进一步研究雷公藤甲素(triptolide,TP)对缺氧再灌注损伤的H9c2心肌细胞产生及释放CK、LDH、ROS、MDA、SOD水平的影响,探讨其是否对心肌细胞起到保护作用及其内在机制,为减轻心肌细胞缺血再灌注损伤提供新的实验依据。方法:1.标本选取:选取培养至指数增长期的H9c2心肌细胞,根据需要的检测指标的不同,分别铺板96孔板或24孔板;2.模型制备:利用缺氧装置建立心肌细胞缺氧再灌注损伤模型:给予TP1、5、10、20、50、100nmol/L缺氧处理4 h,继而复氧4h;3.检测指标:缺氧再灌注作用结束后,用CCK-8法测定细胞增值率及存活率,同时倒置显微镜下观察细胞形态学改变;获取缺氧再灌注处理后的细胞上清,利用相应的检测试剂盒检测细胞培养上清中的心肌酶及氧化/抗氧化水平:微量酶标法检测CK、LDH含量,化学荧光法检测细胞内ROS含量,TBA法检测MDA含量,羟胺法检测SOD含量;4.数据分析:实验测得全部数据,计量资料均用均数±标准差((?)±s)来描述,经方差齐性检验、正态分布检验后,采用t检验进行统计分析,应用GraphPadPrism6.0作图软件进行统计作图,P0.01或0.05,可以认为组间差异有统计学意义,全部实验至少重复3次。结果:(1).本实验经过缺氧4小时,再灌注4小时处理H9c2心肌细胞后,成功制备了心肌细胞缺氧再灌注损伤的细胞模型。且缺氧再灌注处理后,可明显降低H9c2心肌细胞的增殖率(P0.05),提示缺氧再灌注损伤可造成心肌细胞死亡及其形态学改变;(2).各浓度TP处理组H9c2细胞生存率明显高于对照组,细胞形态学改变也较轻,其中以TP100、50、20、10nmol/L组的保护作用最为显著(P0.01);(3).加用TP的各组细胞上清中CK、LDH、MDA水平明显低于对照组,SOD活性明显高于对照组,其中以TP50、20nmol/L组的变化最为显著(P0.01);(4).荧光显微镜下观察:TP可降低H9c2心肌细胞内ROS水平,并在本实验设置浓度范围内呈浓度依赖性,降低程度以TP50、20nmol/L组最为明显。结论:(1).缺氧4小时,再灌注4小时处理可造成H9c2心肌细胞损伤,导致细胞凋亡增加,正常心肌细胞形态发生改变。(2).TP对缺氧再灌注诱导的H9c2心肌细胞损伤具有保护作用,可减少细胞死亡,维持细胞膜完整性,其中机制可能是通过减轻心肌细胞的脂质过氧化水平,增强心肌细胞的抗氧化水平实现的,并且该保护作用与TP之间存在浓度依赖。提示TP的应用可能成为减轻心肌细胞缺氧再灌注损伤的新策略。
【图文】：

缺氧再灌注,处理组,增值率,心肌细胞

结果1 H9c2 心肌细胞缺氧再灌注损伤模型制备1.1 缺氧再灌注处理对细胞增值率的影响分别加入 TP100、50、20、10、5、1nmol/L 进行处理(图增殖率与缺氧再灌注处理组相比，两组相应 TP 浓度组比10nmol/L 组差异不具统计学意义，而 TP5、1nmol/L 组差异对缺氧再灌注损伤 H9c2 细胞的存活增殖具有保护作用，且选择未加入 TP 的缺氧再灌注组及正常培养组，倒置显正常培养的 H9c2 细胞呈现长梭形，大小均匀，形态规则，可见。缺氧再灌注损伤组的细胞出现形状改变，细胞表面皱细胞不再呈现梭形外观，甚至变圆，细胞膜不完整，边界不宽。

缺氧再灌注,心肌细胞

缺氧再灌注损伤组的细胞出现形状改变，细胞表面皱缩、体积变小，一细胞不再呈现梭形外观，甚至变圆，细胞膜不完整，，边界不清，细胞间隙明显宽。图 1 缺氧再灌注损伤对 H9c2 心肌细胞增值率的影响( x±s，n =9) 注：缺氧再灌注组和正常培养组比较：黑色表示缺氧再灌注处理组，灰色表示正常培养组，两组比较，*P<0.05。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】