基于生物信息学的何首乌肝损伤模型大鼠胆汁淤积现象及肝损伤机制研究

发布时间：2020-06-13 23:01

【摘要】：目的:利用生物信息学技术,使用数据库结合软件快速对本课题组前期经过ITRAQ筛选出的何首乌相关差异蛋白进行基于本体论注释的聚类分析,蛋白质相互作用分析,同时使用经内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肝损伤炎症模型,研究何首乌对该模型的肝损伤作用,并进一步检测胆汁淤积相关指标,从而为阐明何首乌肝毒性机制提供线索,为后续实验奠定理论基础。方法:对差异蛋白进行GO聚类分析、蛋白质互作分析、KEGG通路分析与Meta Core蛋白互作网络富集分析。然后将136只体重为180-200 g的雄性SD大鼠分为以下5组:空白对照组(Ctrl)、LPS组(LPS)、LPS+对乙酰氨基酚(LPS+APAP)、何首乌组(AEP)和LPS+何首乌组(LPS+AEP)。并按动物体重,尾静脉注射给予LPS组、LPS+AEP组4 mg/kg LPS。2 h后灌胃给予AEP组和LPS+AEP组12 g/kg(相当于临床给药剂量22倍)何首乌,每日一次,连续给药7天建立特异质肝损伤炎症模型。观察体重变化,进行肝脏系数及组织病理学检查,并分别取第2 h、14 h、5 d、8 d四个时间点检测血生化肝功能相关指标同时收集胆汁,计算胆汁流速与密度并检测胆汁中主要成分变化。对胆汁淤积相关蛋白胆盐输出泵转运蛋白(BSEP)、多药耐药蛋白2(MRP2)及多药耐药蛋白3(MRP3)进行Real-Time PCR检测。结果:1.通过ITRAQ技术筛选找出17β-羟基固醇类脱氢酶2、碳酸酐酶同工酶、重组人蛋白酪氨酸磷酸酯酶非受体1型、细胞色素P450 2B1(CYP2B1)、60S核糖体蛋白L13、雌激素硫酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶2、线粒体ATP合成酶复合体亚基C1、超氧化物歧化酶2(SOD2)等36种蛋白质作为潜在LPS激活何首乌肝损伤的生物标志物,为何首乌肝毒性研究提供检测和预防的检查手段。进一步对这些蛋白进行蛋白网络互作分析,发现一些重要蛋白:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶2b17(UGT2B17)、CYP2B13、CYP2C6、雌激素硫酸转移酶2、17β-羟基固醇类脱氢酶2、60S核糖体蛋白L10、40S核糖体蛋白S23、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽还原酶、烯脂酰-Co A还原酶、酰基辅酶A硫酯酶5、锌转运蛋白10、锌转运蛋白、线粒体导入受体亚基TOM6同族体、线粒体ATP合成酶复合体亚基C1。2.在差异蛋白的GO中,与细胞组成相关的有156条,与分子功能相关的有98条,与生物过程相关的有321条。3.经过KEGG pathway分析,发现这些差异蛋白主要参与甾类激素生物合成途径、核糖体途径、化学致癌途径、视黄醇代谢途径、原发性免疫缺陷途径等。4.通过Meta Core对网络分布进行富集分析,我们发现差异蛋白主要参与炎症系统如IL2、IL6信号传导通路、免疫相关信号如MHC家族相关的抗原呈递途径、抗原呈递的吞噬小体信号通路、胆汁酸代谢调节、线粒体细胞凋亡、DNA损伤修复等途径。5.成功建立的经LPS诱导的何首乌肝损伤SD大鼠模型;6.经过LPS诱导2 h后LPS+AEP组与空白对照组、AEP组相比体重明显下降,至8 d肝脏系数显著增加(P0.05)。血清生化指标显示,LPS+AEP组ALT,AST水平无明显变化。8 d的TBIL明显降低(P0.05)而ALP升高(P0.05),LPS+AEP组可观察到胆汁密度和胆汁流速明显降低。对胆汁成分分析显示TCHO升高,TBIL显著降低(P0.05)。病理结果显示AEP组出现轻微肝细胞变性,而LPS+AEP组可见严重局灶坏死。转录水平结果发现LPS诱导后可使得BSEP、MRP2在14 h时出现短期抑制(P0.05),单独给予AEP可使BSEP、MRP2和MRP3的表达水平显著升高(P0.05,P0.01)。而LPS+AEP给药第8 d对大鼠肝脏BSEP、MRP2无显著性影响,但可使MRP3转录水平升高(P0.05)。结论:1.通过分析差异蛋白的GO注释,发现这些蛋白主要代谢、免疫、应激反应、细胞杀伤等方面来影响机体功能。2.通过蛋白质互作分析发现了一些可能与肝毒性机制相关的差异蛋白,分别是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶2b17(UGT2B17)、CYP2B13、CYP2C6、雌激素硫酸转移酶2、17β-羟基固醇类脱氢酶2、60S核糖体蛋白L10、40S核糖体蛋白S23、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽还原酶、烯脂酰-Co A还原酶、酰基辅酶A硫酯酶5、锌转运蛋白10、锌转运蛋白、线粒体导入受体亚基TOM6同族体、线粒体ATP合成酶复合体亚基C1。根据分析结果推测可能与胆红素代谢相关。3.通过KEGG pathway分析发现这些差异蛋白参与的主要代谢途径有:甾类激素生物合成途径、核糖体途径、化学致癌途径、视黄醇代谢途径、原发性免疫缺陷途径。4.通过Meta Core对网络分布进行富集分析,我们发现除了与炎症系统如IL2、IL6信号传导通路、免疫相关信号如MHC家族相关的抗原呈递途径、抗原呈递的吞噬小体信号关联较大以外,还与胆汁酸代谢调节有关。5.经LPS诱导的何首乌醇提液可明显损伤大鼠肝细胞并干扰胆汁分泌功能,改变大鼠胆汁成分引起相关生化指标的改变。BSEP与MRP2水平无显著影响,而MRP3水平出现代偿性升高,提示确实存在胆汁淤积症状,但可能存在其他机制。
【图文】：

示意图,胆汁,多药耐药蛋白,胆汁盐

广东药科大学硕士研究生毕业论文ABCB11），是胆汁盐依赖性小管胆汁分泌的主要决定因素[59]和多药耐药蛋白-2（MRP2，ABCC2）通过谷胱甘肽的排泄确定胆汁盐独立胆汁流[57]。 MRP2 还将药物缀合物和二价胆汁盐缀合物输送到胆汁中。其他 ATP 依赖性转运蛋白包括运输有机阳离子（叔胺或季胺）的多药耐药蛋白（MDR1，ABCB1），运输有机阴离子（包括药物偶联物）的乳腺癌耐药蛋白（BCRP，ABCG2）和多药耐药蛋白 3（MDR3，，ABCB4），磷脂翻转酶。

技术流程,蛋白

图 2.iTRAQ 技术流程2 实验方法2.2.1 蛋白筛选方法旨在采用不同的筛选方法以筛选出肝损伤机制可能相关蛋白。（1）采用第 8 天 LPS+AEP 组蛋白与空白对照组差异蛋白进行筛选第14小时LPS对肝损伤影响较大而何首乌无明显影响，因此采用第8天LPS+蛋白与空白对照组差异蛋白（8d-G4/8d-G1）进行筛选。（2）排除 LPS 影响因 LPS 本身会导致急性肝损伤，而第 5 天之后 LPS 组的大鼠体重明显恢复， LPS 影响逐渐减弱，但第 8 天 LPS+AEP 组与空白对照组（8d-G2/8d-G1）不能完除其影响，因此需要排除 LPS 影响。（4）第 8 天 AEP 组与空白对照组（8d-G3/8d-G1）差异蛋白
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】