白露汤对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用及机制实验研究

发布时间：2020-06-14 03:58

【摘要】：研究背景:肺癌是全球范围内,最为常见的恶性肿瘤,导致大量的癌症患者死亡(每年全球总数约为700万),肺癌发病率高且生存期短,最为多见的肺癌类型就是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。在中医传统古籍中就有相关“肺癌”病症的描述,如“肺积”“肺痈”等,围绕“整体辩证”的论治思想,众医家结合肺癌患者的证型灵活选用中药复方发挥其优势:抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、增强肺癌患者机体免疫力等。本研究中的白露汤是在临床中自拟中药复方,适用于气阴两虚、痰瘀蕴肺型的肺癌患者。研究目的:研究白露汤对人肺腺癌A549的抑制作用以及与顺铂的协同增效作用,探讨其对人肺腺癌A549的Warburg效应的作用及调控机制,为白露汤临床应用提供实验依据。研究方法:第一部分:白露汤对人肺腺癌A549细胞抑制作用采用三维(3D)培养法培养人肺腺癌A549细胞系,应用血清药理学方法,制备SD大鼠白露汤含药血清。随机分为8组:对照组(A组)、白露汤含药血清低剂量组(B组)、白露汤含药血清中剂量组(C组)、白露汤含药血清高剂量组(D组)、顺铂组(E组)、顺铂加白露汤含药血清低剂量组(F组)、顺铂加白露汤含药血清中剂量组(G组)和顺铂加白露汤含药血清高剂量组(H组)。A549细胞常氧条件下3D培养72h后,按照分组分别加入相应的含药血清或药物继续培养48h。检测各组细胞培养上清液的pH值;CCK8法检测各组细胞活力;酶标仪检测各组细胞乳酸(LD)和三磷酸腺苷(ATP)水平的变化;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;Western-Blot法和RT-PCR法检测各组细胞葡萄糖转运体-1(GLUT1)、己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶-2(PKM2)、乳酸脱氢酶-A(LDH-A)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的基因及蛋白的表达。第二部分:白露汤对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制作用清洁级雄性BALB/c-nu裸鼠,右侧背下皮肤接种人肺腺癌A549细胞,制备A549裸鼠移植瘤模型。经筛选后随机分为8组:对照组(A组)、白露汤低剂量组(B组)、白露汤中剂量组(C组)、白露汤高剂量组(D组)、顺铂组(E组)、顺铂加白露汤低剂量组(F组)、顺铂加白露汤中剂量组(G组)和顺铂加白露汤高剂量组(H组)。除对照组和顺铂组外,其余各组分别灌胃给予相应的浓度的白露汤剂,每日1次,连续给药3周。顺铂组和顺铂加白露汤低、中、高剂量组腹腔注射顺铂(2 mg/kg),每3 d注射1次。对照组灌胃给予等体积的生理盐水。观测肿瘤的生长曲线和抑瘤率;HE染色检测肿瘤病理变化;比色法检测肿瘤组织中乳酸、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平;TUNEL法检测细胞凋亡;免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达;Western-Blot法和RT-PCR法检测各组细胞葡萄糖转运体-1(GLUT1)、己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶-2(PKM2)、乳酸脱氢酶A(LDH-A)和低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因及蛋白的表达。研究结果:第一部分白露汤对人肺腺癌A549细胞的抑制作用结果1.CCK8检测细胞活力结果:各给药组与对照组相比,均有不同程度降低,有明显差异(P0.05);与顺铂组相比,顺铂加白露汤含药血清低剂量组、顺铂加白露汤含药血清中剂量组和顺铂加白露汤含药血清高剂量组细胞活力均有不同程度降低,且随着白露汤含药血清剂量的增加细胞活力下降。2.A549细胞内乳酸、ATP结果:与对照组相比,各给药组乳酸、ATP水平均有不同程度降低,(P0.01)有显著差异;与顺铂组相比,顺铂加白露汤含药血清低剂量组、顺铂加白露汤含药血清中剂量组和顺铂加白露汤含药血清高剂量组细胞LD、ATP水平均有不同程度降低,且随着白露汤含药血清剂量的增加,其LD、ATP水平随之下降。3.流式细胞仪结果:各给药组细胞与对照组细胞相比后,细胞凋亡率均有不同程度升高(P0.05);与顺铂组相比,顺铂加白露汤含药血清低剂量组、顺铂加白露汤含药血清中剂量组和顺铂加白露汤含药血清高剂量组细胞凋亡率均有不同程度升高,随着白露汤含药血清剂量的增加,其细胞凋亡率升高。4.RT-PCR与Western blot结果:各组细胞GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α的基因及蛋白表达与对照组相比,均有不同程度的降低,有明显差异(P0.01);与顺铂组相比,顺铂加白露汤含药血清低剂量组、顺铂加白露汤含药血清中剂量组和顺铂加白露汤含药血清高剂量组细胞GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α的基因及蛋白的表达均有不同程度降低,随着白露汤含药血清剂量的增加,A549的GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表达随之降低。第二部分白露汤对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制作用结果1.肿瘤体积和瘤重结果:各给药组与对照组相比,肿瘤体积和瘤重均有不同程度减小,P0.01;与顺铂组相比,顺铂加白露汤低剂量组、顺铂加白露汤中剂量组和顺铂加白露汤高剂量组肿瘤体积和瘤重均有不同程度减小,且随着白露汤剂量的增加,其肿瘤体和瘤重随之降低。2.HE染色结果:与对照组相比,各给药组肿瘤组织肿瘤细胞数目明显减少,细胞核固缩,胞质肿胀或融合,结缔组织增多并绕分隔肿瘤细胞,毛细血管明显减少。随着白露汤剂量的增加,上述病理表现加重。3.乳酸、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP结果:与对照组比较,各给药组肿瘤组织中LD、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平均有不同程度降低,P0.01;顺铂加白露汤低剂量组、顺铂加白露汤中剂量组和顺铂加白露汤高剂量组与阳性组相比,肿瘤组织中LD、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平均有不同程度降低,随着白露汤剂量的增加,其LD、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平随之下降。4.免疫组化结果:与对照组相比,其它组肿瘤组织中细胞凋亡数目、Bax和Caspase-3蛋白表达均有不同程度增多,Bcl-2蛋白表达明显减少,有明显差异P0.01;与阳性组相比,顺铂加白露汤低剂量组、顺铂加白露汤中剂量组和顺铂加白露汤高剂量组肿瘤组织中细胞凋亡数目、Bax和Caspase-3蛋白表达均有不同程度增多,Bcl-2蛋白表达明显减少,且随着白露汤剂量的增加,变化越明显。5.RT-PCR与Western blot结果:与对照组比较后,其它组的肿瘤组织中GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表达均有不同程度的降低,(P0.01、P0.05);与阳性药物组相比,顺铂加白露汤低剂量组、顺铂加白露汤中剂量组和顺铂加白露汤高剂量组肿瘤组织中GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表达均有不同程度的降低,随着白露汤剂量的增加,组织中GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表达随之降低。研究结论:通过体外和体内实验研究表明1.白露汤对人肺腺癌A549有明显的抑制作用,与顺铂联合能增强其抑制效果。2.白露汤能通过降低人肺腺癌A549 LDH和ATP水平,从而抑制肿瘤细胞的能量代谢。3.白露汤能通过调控人肺腺癌A549凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表达,从而促进肿瘤细胞的凋亡的发生和发展。4.白露汤能通过抑制GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A、HIF-1α的基因与蛋白表达,从而调控人肺腺癌A549糖酵解过程。 【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

【图文】：

能量图,肿瘤细胞,能量

图 4.2 肿瘤细胞能量反应详解图糖酵解与抗癌治疗细胞生物学、细胞病理学的研究深入，，肺癌的治疗锁定于肿瘤细目标治疗。以往的治疗主要是采用细胞毒作用的药物，会对正常生损伤。近十年来，代谢组学与蛋白质组学为开发潜在的抗癌药一个令人兴奋的治疗方法，拓展了对肿瘤的治疗视野，发现改变的能量代谢是治疗的关键，通过对细胞内微环境（主要是能量代

吸光值

分组 OD 值A 1.443±0.026B 1.301±0.122*C 1.263±0.111*D 1.173±0.081*E 1.215±0.096*#F 1.213±0.032*G 1.197±0.042*H 1.132±0.080* 与对照组比较，*P＜ 0.01；与 E 组比较，#P＜ 0.01。

【参考文献】