黄芩素对高脂诱导的肝铁代谢紊乱的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-06-14 17:27

【摘要】：目的:探讨溶酶体及NCOA4介导的铁蛋白降解和溶酶体膜V-ATPase复合物的组装在非酒精性脂肪肝(NAFLD)铁代谢紊乱中作用及黄芩素拮抗效应的潜在分子机制方法:1.动物实验:将105只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠(体重18-20 g)随机分为7组:正常对照组(低脂饲料,10%脂肪供能)、高脂饲料组(高脂饲料,60%脂肪供能、黄芩素对照组(黄芩素:400 mg/kg.bw)、高铁组对照组(羰基铁粉w/w:0.2%)、黄芩素+高脂组(黄芩素:400 mg/kg.bw)、高脂+铁联合组、黄芩素+高脂+铁组(黄芩素:400 mg/kg.bw),小鼠高脂喂养12周至模型成功后,处死小鼠并收集血清及组织样本。测定血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及血脂水平;苏木素-伊红及油红O染色观察肝脏病理改变及脂质沉积;测定肝组织甘油三酯、总胆固醇、氧化损伤及铁水平相关指标;检测溶酶体低分子质量铁含量、溶酶体V-ATPase复合物V1亚基表达;肝脏石蜡切片孵育V-ATPase B2及溶酶体膜相关蛋白2(LAMP2)抗体观察胞浆V-ATPase复合物V1亚基与溶酶体共定位的水平。2.细胞实验:根据实验目的加入不同的干预物及NCOA4 siRNA、Sestrin2siRNA处理经游离脂肪酸(FFA)、黄芩素及柠檬酸铁铵(FAC)刺激的人肝癌细胞(HepG2),BODIPY493/503染色观察HepG2细胞内脂质沉积;检测细胞内NCOA4、Sestrin2、蛋白质氧化损伤及自噬相关蛋白的表达;银硫染色法观察溶酶体内低分子质量铁含量;检测细胞内铁水平、溶酶体V-ATPase复合物组装及溶酶体pH值等相关指标。结果:1.黄芩素干预有效的抑制高脂喂养导致的小鼠肝脏谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的释放、脂肪变性与氧化损伤;与高脂喂养小鼠组相比,黄芩素干预升高了1.56倍肝脏总铁(p0.05),和1.27倍游离铁(LIP)的水平(p0.05)。同时,高脂喂养导致小鼠溶酶体氧化还原活性铁含量升高了5.23倍(p0.05)、溶酶体胞浆组织蛋白酶B的活性增加了20.8%(p0.05)、成熟形式组织蛋白酶D表达降低、溶酶体膜V-ATPase复合物V1亚基表达降低,胞质蛋白V-ATPase B2与LAMP2共定位减少,而黄芩素干预部分逆转了上述变化。2.黄芩素干预能改善FFA刺激导致的细胞内脂质沉积,LIP下降、溶酶体活性铁沉积及溶酶体功能。Bafilomycin A1处理导致FFA孵育的HepG2细胞铁蛋白蓄积,胞浆LIP降低及溶酶体氧化还原活性铁含量进一步升高,部分抵消了黄芩素的保护效应,Rapamycin刺激能恢复FFA处理的细胞溶酶体pH值,进而导致细胞内铁蛋白重链(FTH)及胞浆LIP升高(p0.05),溶酶体低分子质量铁含量降低。3.黄芩素干预能进一步增加高脂喂养小鼠Sestrin2蛋白水平、降低mTOR表达、溶酶体内ROS及增高线粒体膜电位(MMP)(p0.05)。抑制Sestrin2表达,导致细胞铁蛋白蓄积,胞浆LIP降低、溶酶体内氧化还原活性铁含量增加、pH升高及胞质蛋白V-ATPase B2与溶酶体膜LAMP2共定位减少(p0.05),部分抑制了黄芩素的保护效应。敲低细胞内Sestrin2的表达,导致mTOR磷酸化表达增高,抑制黄芩素对mTOR调控作用;加入Rapamycin处理降低mTOR表达,且能降低黄芩素干预细胞内铁蛋白水平,升高细胞内LIP含量(p0.05),降低溶酶体内pH值。同时,敲低细胞内Sestrin2的表达,导致蛋白质羰基化水平增加,黄芩素抗氧化能力减弱;加入N-acetylcysteine处理降低蛋白质氧化损伤程度,且能降低黄芩素干预细胞内FTH表达及溶酶体内pH值,但铁蛋白轻链(FTL)表达增加(p0.05)。4.抑制蛋白酶体活性不能抑制黄芩素对铁蛋白降解的作用及溶酶体功能的保护效应;自噬抑制剂能部分阻滞黄芩素介导的铁蛋白降解,降低胞浆内LIP水平,但对溶酶体内氧化还原活性铁含量无影响。黄芩素干预拮抗FFA引起的NCOA4与p62蓄积、Beclin1降低(p0.05);NCOA4敲低导致细胞内FTH蓄积,抑制黄芩素对铁蛋白的降解作用,降低胞浆内LIP水平(p0.05);在FAC与FFA联合处理组,抑制NCOA4表达,能降低溶酶体内氧化还原活性铁及胞浆内LIP水平(p0.05),部分恢复溶酶体膜稳定性及增高溶酶膜V-ATPase复合物V1亚基表达。结论:溶酶体V-ATPase复合物组装和溶酶体及NCOA4介导铁蛋白降解在非酒精性脂肪肝肝铁紊乱中发挥重要的作用,黄芩素能促进溶酶体V-ATPase复合物组装,降低溶酶体pH值,增强溶酶体及NCOA4介导的铁蛋白降解可能是改善非酒精脂肪肝铁减少的重要机制之一;并且黄芩素可以上调Sestrin2抑制mTOR表达,减轻氧化应激而增强溶酶体V-ATPase复合物组装,恢复溶酶体酸性环境;调节Sestrin2/mTOR/ROS可能是黄芩素改善非酒精脂肪肝致溶酶体V-ATPase复合物组装异常的主要分子机制。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】