基于质量控制的糖肾康丸药效评价及代谢组学初步研究

发布时间：2020-06-15 15:16

【摘要】：目的:基于名中医临床经典名方的传承,开发糖肾康处方水丸剂型的医疗机构制剂的新药研究。以糖肾康水丸剂的药效学及其代谢组学的系统性相关研究,为该制剂在临床上治疗和预防糖尿病肾病的作用机制提供理论研究基础。方法:1.根据该经典处方临床上使用习惯和处方组成药味的特点,结合中药水丸制备工艺的特性,针对处方中水煎煮的工艺路线,采用三因素三水平L_9(3~4)正交试验对水煎煮加水量、煎煮时间及煎煮次数主要影响因素进行考察,利用高效液相色谱法测定处方中黄芪的代表性组分黄芪甲苷的提取率与水煎煮的总固形物重量综合加权,统计学处理优化提取工艺最佳路线。在提取工艺的研究基础上,针对糖肾康水丸进行制剂学研究,制定糖肾康水丸的成型制剂工艺,根据三批中试原料投料量和制剂成品合格率偏差对制剂工艺验证。采用薄层色谱法对制剂中处方药味专属性鉴别,建立符合医疗机构制剂的糖肾康水丸质量标准。2.结合药效学研究,采用基于UPLC-Q-TOF-MS技术的代谢组学研究方法,对大鼠尿液小分子内源性代谢组分以正负离子模式扫描检测供试品,m/z 100~1500;利用PLS-DA(偏最小二乘法-判别分析)检测糖肾康丸对治疗糖尿病肾病大鼠尿液和血清潜在生物标记物含量的影响,从代谢通路角度探讨糖肾康丸干预治疗糖尿病肾病的作用机理。结果:1.经过三批中试工艺验证试验,糖肾康水丸的最佳成型工艺:取处方标示量中黄芪的半量,与处方中茯苓、乌梅、苍术、山药、川芎等其余药味粉碎成细粉,备用;处方中剩余的半量黄芪,与处方中其余黄精、山茱萸、地黄、水蛭等药味加水10倍量,煎煮2次,每次2小时,水煎煮液滤过,滤液合并,将滤液浓缩至相对密度1.25-1.30(60℃)的浸膏,将浸膏与前述备用药粉混匀,干燥,粉碎成细粉;制备水泛丸制剂,称取起模用药粉量14%,起模,泛水丸,用水量45%,制成的糖肾康浓缩水丸,三批水丸成品率与投药量比均在误差范围内,工艺稳定。2.对糖肾康水丸建立符合医院自身质控条件的医疗机构制剂质量标准的研究,对处方中黄芪、川芎、乌梅、茯苓进行薄层色谱鉴别。各鉴别的药味专属性成分的分离度Rf值均符合比移值范围,各药味的阴性对照制剂均无干扰。3.糖肾康丸各给药组与模型组比较,糖肾康丸各给药组与模型组比较,能明显降低空腹血糖值(FBG)、糖化血红蛋白(GHB)含量,以中药中剂量预防组效果最好;能够明显减少尿微量白蛋白(U-mAlb)量,以中药中剂量预防组的作用最好;能够减少血清中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN),以中剂量组效果最明显,而对血β2微球蛋白(β2-MG)的含量的影响各组之间差异不显著。通过对肾脏组织病理学的观察,糖肾康丸治疗组(高、中、低)肾小球硬化程度减轻,系膜细胞和基质增生降低,GBM及肾小管无病变,接近于正常组;但肾小球系膜基质仍轻度增多,中剂量组相对较好。4.DN模型大鼠尿液中10个内源性生物标记物主要通过以下途径作用:氨基酸代谢通路,能量代谢通路、核苷酸代谢(嘌呤代谢通路)。糖肾康中剂量组的大鼠尿液中的标记物基本含量都趋近于假手术组的方向回调,与模型组相比,糖肾康剂量组回调8个标记物,厄贝沙坦组回调7个标记物。结论:1.经工艺验证,以黄芪甲苷提取量为测定指标,与原药材含量比较,水提取工艺黄芪甲苷的转移率均达到60%以上。同时,将处方中粘性较大的药材采用水提取工艺,既可以作为泛水丸的粘合剂,又可以除去部分杂质,并减少临床服用剂量,达到满足临床用药的需求。其制剂的质量标准方法可行,能够保证对该医疗机构内制剂糖肾康水丸剂的质量控制。2.糖肾康丸对早期糖尿病肾病模型大鼠各项指标的改变具有一定的改善和治疗作用。3.糖肾康丸可改善糖尿病肾病引起的代谢紊乱,可能是通过调节氨基酸代谢通路,能量代谢通路、核苷酸代谢等通路的代谢扰动达到其治疗作用,可从代谢通路的角度揭示其治疗作用机理。
【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R283.6
【图文】：

正常人,指纹图谱,患者,代谢物

实验旨在建立基于气相色谱“全”挥发性代谢物的代谢组学分析对糖尿病的治疗效果、时间和剂量效应，同时分析了患者服药前间的生化指标[61]。为建立基于气相色谱的“全”挥发性代谢物的代谢组学分析方法发至干，加入内标采用硅烷化衍生试剂，形成硅烷基产物。实验胺作溶剂，经实验优化衍生试剂与溶剂的比例以 1 ：1 为宜。8样中含羟基、羧基、氨基、巯基等基团的化合物转化为挥发性物图 2 给出气相色谱分析正常人和患者尿样的指纹图谱。研究采衍生的处理方法，可以检测到比有机酸代谢轮廓分析更多的色谱出，这两类样品存在一些差异，其中 20～30min 区域大量代谢物在选定条件下平行进样 5 次，选取共有的 7 个典型色谱峰，考示，这些峰的保留时间和峰面积的 RSD 值分别小于 0.40%和 3.所建立的指纹图谱具有良好的重复性和稳定性。

矩阵图,糖尿病患者,对照组,代谢组学

图 3 糖尿病患者与对照组尿样 PCA 分析A.PCA 的三位得分矩阵图（■：对照，▲：DM2 患者）；B.PCA 的表 3 区分糖尿病患者和正常人的潜在标记物实验建立了尿样全挥发性代谢物的代谢组学分析方法，处理方

【参考文献】