丹皮酚抗慢性应激引起的神经元损伤及其机制研究

发布时间：2020-06-15 21:09

【摘要】：根据世界卫生组织(WHO)的报告,抑郁症是全人类最流行的精神疾病之一,伴随着的症状包括情绪低落、动机减弱、失去兴趣或快乐、自杀想法和无望等,截止2016年全世界所有年龄段的患病人数超过3.5亿。抗抑郁药物已广泛用于治疗抑郁症,并在临床指南中被推荐为中、重度抑郁症发作的首选治疗方法。但是,抗抑郁药仅可使约50%左右的重度抑郁症患者的症状得到完全缓解,且有副作用,如镇静和体重增加。虽然单胺类系统(包括5-羟色胺,去甲肾上腺素和多巴胺系统)长期以来一直是抑郁症研究和治疗的焦点,但新的治疗靶点和药物的开发业已成为目前重要的探索方向之一。越来越多的证据表明,诱导抑郁症的最重要的两个因子慢性应激和心理创伤均可损伤神经元。保护神经元免受损伤可能为未来抑郁症的防治提供新的药物靶点。在我国,多酚类中草药的临床应用已有数千年历史。多酚通常容易被胃肠道吸收并迅速穿过血脑屏障。丹皮酚(Paeonol,2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮,C_9H_(10)O_3)是一种典型的多酚物质,是从著名的牡丹皮中提取的酚酸化合物。已经确定的是,丹皮酚具有多种临床治疗效果。近期的研究发现丹皮酚应用能减轻脂多糖诱导的小鼠抑郁样行为,但其细胞分子机制仍然知之甚少。因此,在本研究中,我们运用丹皮酚治疗慢性应激诱导的抑郁症动物模型,旨在进一步理解其作用的细胞分子机制,为开发潜在的防治抑郁症新的药物提供实验基础。在本研究中,我们通过慢性不可预知温和应激(CUMS)诱导大鼠抑郁症模型。用旷场实验(OFT)、高十字架迷宫实验(EPMT)、强迫游泳实验(FST)和糖水偏好实验(SPT)进行行为学评价,分析丹皮酚对CUMS诱导的自主探究活动性下降、焦虑情绪、快感缺失等方面的影响。同时运用Golgi-cox染色结合Sholl分析软件、ImageJ软件和RECONSTRUCT三维重建软件,分析丹皮酚对CUMS诱导的大脑神经元树突的形态变化包括树突长度、树突分支数目和棘突密度变化的影响;并在此基础上进一步通过免疫荧光双标、western blot实验来探究丹皮酚对CUMS诱导的脑部相关区域神经元损伤的潜在的分子机制。结果如下:1.丹皮酚可以阻止CUMS诱导的大鼠行为学损伤。慢性不可预知温和应激导致大鼠在旷场试验中显示出较低的活性和较少的穿越水平格数(两者均为P0.05),在高架十字迷宫试验中在开放臂中花费的时间较少(P0.05),在蔗糖偏好试验中蔗糖消耗量较少(P0.05),强迫游泳试验中的不动时间增多(P0.01)。在旷场试验中,对照组和氟西汀治疗组(P0.05)或CUMS组和高剂量丹皮酚治疗组的活性也有显着差异(P0.05);在强迫游泳试验中,CUMS组与氟西汀治疗组(P0.01)、与低剂量丹皮酚治疗组(P0.001)或与高剂量丹皮酚治疗组(P0.01)差异显著;在蔗糖偏好测试中的蔗糖消耗量,CUMS组与氟西汀治疗组(P0.05)或CUMS组和高剂量丹皮酚治疗组之间(P0.05)差异显著。这些数据表明,丹皮酚治疗显着减弱CUMS诱导的行为损害。2.丹皮酚可显著缓解CUMS诱导的大鼠相关脑区的神经元损伤。在本研究中,我们对内侧额叶、杏仁核、海马和伏隔核等相关脑区神经元树突的长度和分支数、神经元树突棘的密度和类型百分比进行了详细的研究。其中,在同一神经元上,我们对神经元的顶树突和总树突长度分别进行了统计,对不同节段上树突分支与同心圆交叉点数分别进行了统计,对不同区域位置即基树突区域、顶树突近胞体端和远胞体区域的树突棘密度和类型百分比分别进行了统计。同时根据测量的树突棘的大小,由RECONSTRUCT三维重建软件对激光共聚焦三维图像进行分析,将树突棘自动分为三种类型:丝/线型(长度1μm或长宽比1)、短棒型(ST,长宽比≤1以及长度1μm)和蘑菇/分支型(MB,宽度0.6μm或形态“分支状”)。分析结果不难看出,慢性应激可以普遍诱导各脑区神经元树突长度变短、树突分支数减少,树突棘密度降低,而氟西汀或丹皮酚的使用则可阻止或减缓这些改变。但从棘突的不同类型来分析,可以发现,慢性应激对不同脑区影响虽有所不同,但总的来说对不同的棘突类型影响的结果是不一样的:较为一致的现象是,慢性应激可降低蘑菇或分支状型棘突的密度,但却往往伴随着增加丝/线型棘突的密度;同样氟西汀或丹皮酚的使用则可阻止或减缓这些变化趋势。因此,Paeonol缓解慢性应激诱导的相关脑区的神经元的损伤,可能主要是通过减少神经元树突的丢失,增加功能性树突棘——蘑菇/分支型棘突的密度,进而缓解相应的行为学表现。3.丹皮酚处理可有效缓解CUMS诱导的cofilin1的活性紊乱以及在神经元中的重新分布。cofilin1是组成神经元树突棘骨架的肌动蛋白细丝重塑最重要的调节因子之一,可通过对其Ser3位点去磷酸化或从结合于膜蛋白上释放入胞质而激活。cofilin1的过度激活或失活均可导致肌动蛋白重塑以及树突和突触的丢失。我们的结果显示,慢性应激诱导了cofilin1水平在mPFC和海马增加,而在杏仁核减少;诱导了p-cofilin1水平在杏仁核和伏隔核中增加,在mPFC中减少,而在海马中则没有显著变化;同时还在一些脑区如海马诱导cofilin1增加在胞质中的分布。这些变化,通常会在氟西汀或丹皮酚处理后得以缓解。这暗示,cofilin1的激活或失活多是通过改变其表达水平和磷酸化修饰,也有通过调节与膜蛋白的结合,另一方面cofilin1的激活或失活在不同脑区是不一样的,具有脑区特异性;可能正是cofilin1活性的改变,影响了actin的重塑,进而改变了树突和树突棘的形态。4.丹皮酚处理可显著缓解CUMS诱导的Rho GTPase(Rac1,CDC42和RhoA)水平改变。Rho GTPase作为分子开关,可以介导多种胞内外信号分子,通过多种信号通路作用下游靶蛋白,包括cofilin1。我们的数据显示,慢性应激普遍改变了GTPase的表达水平:降低了mPFC的Rac1和RhoA水平,增加了杏仁核和海马的Rac1和Rho A水平,降低了伏隔核的Rac1水平,却增加了伏隔核的CDC42和RhoA水平。不同浓度的丹皮酚或氟西汀的使用多数都能缓解上述开关分子的改变。这样的结果提示,GTPase-cofilin1信号通路可能参与了Paeonol缓解慢性应激诱导的神经元树突棘丢失和树突萎缩的生理过程。我们的结果还提示,在一些脑区如海马BDNF可能通过TrKB受体介导影响GTPase-cofilin1信号通路。5.丹皮酚可显著缓解CUMS诱导的某些脑区GSK3β和calcineurin(CaN)表达水平的变化。研究显示,GSK3β和calcineurin可能参与慢性应激诱导的cofilin1改变和行为损伤。我们的结果揭示,在一些脑区,如在杏仁核,慢性应激降低了CaN水平,丹皮酚的使用(高或低剂量)均可阻止其下降;慢性应激却提高了GSK3β的水平,但高剂量丹皮酚或氟西汀的处理却可以缓解GSK3β水平的提高。这说明,CaN和GSK3β在某些脑区如杏仁核也参与了Paeonol缓解慢性应激诱导的神经元树突棘丢失和树突萎缩的生理过程。综上所述,丹皮酚可显著减轻慢性应激诱发的行为损伤。这些行为的损伤可能与相关脑区的树突棘丢失和树突萎缩存在因果关系。与这些树突形态改变一致的是cofilin1活性的紊乱,伴随着不同脑区Rho GTPase表达水平的改变,以及BDNF和/或GSK3β/calcineurin的改变。上述紊乱或改变多可由丹皮酚处理得到缓解。我们的数据暗示,丹皮酚在不同脑区可以通过GTPase-cofilin1或GSK3β/calcineurin等多种信号通路减弱CUMS诱导的突触和树突损失,并最终改善行为缺陷。我们的实验也提示丹皮酚可能是治疗抑郁症的潜在药物。
【学位授予单位】：安徽师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

树突棘,树突,颈部直径,锥体神经元

图 1.上图表示一个棘的放大。下图为来自大鼠脑的不同多棘神经元的形态学。大脑皮质层II/III 的锥体神经元（A）；CA1（B），CA3（C）海马区;内嗅皮质层 II/III（D）; 来自纹状体的中等棘神经元（E）以及来自这些相应区域（F-J）的树突棘的形态。Golgi-Cox 染色所揭示的。（K）-（N）为培养 21 天后 DiI 染色的海马和皮质神经元及其树突棘图像。（O）表示一个典型的树突上各类型棘分支（注意：不同的参数，包括总树突长度，树突直径，棘面积，棘长度和棘头部和颈部直径被测量）。图截取自文献(Maiti, Manna, Ilavazhagan,Rossignol, & Dunbar, 2015)Fig. 1 The figure above showed an enlarged spine. The figure below showed the morphologyof different spiny neurons from rat brain. Pyramidal neurons from layer-II/III of cerebralcortex (A); CA1 (B), CA3 (C) regions of hippocampus, layer-II/III of entorhinal cortex (D);medium spiny neuron from the striatum (E), and the morphology of dendritic spines fromtheses respective regions (F J) as revealed by Golgi Cox stain. (K) (N) Images ofhippocampal and cortical neurons and their dendritic spines stained by DiI after 21 days inculture. (O) schematic diagram of a typical dendritic branch with spines (Note: Differentparameters, including total dendritic length, dendritic diameter, spine area, spine length andspine head and neck diameter are measured to study spine pathology). These figures werecut from the literature:(Maiti et al., 2015) .在个体发育过程中，树突棘的结构和功能并不固定，不断变化表现出不同树

示意图,丹皮酚,氟西汀,示意图

1.1.4 分组动物适应性饲养一周，用 Open-field 行为学评分，选择评分相近的动物，将大鼠随机分为正常对照组（Co）、抑郁症模型组(chronic unpredictable mild stress，CUMS,Cu）、氟西汀组（Fl，10mg / kg，ig）、丹皮酚低剂量组（Pl，25mg / kg，ig）和丹皮酚高剂量组（Ph，80mg / kg，ig）。正常对照组每笼饲养 6 只，共 36只；抑郁症模型组、氟西汀组、丹皮酚低剂量组和丹皮酚高剂量组每笼饲养 1 只( 分养) 共 144 只。在 CUMS 诱导后一周，每日在 CUMS 前 1 小时给予氟西汀或丹皮酚 4 周。Co 的预处理是体积匹配的生理盐水。

【参考文献】