苦参黄酮类化合物的提取分离和生物活性研究

发布时间：2020-06-17 23:51

【摘要】：苦参为我国传统中药材之一,收录于《本草纲目》草部第十三卷,来源于豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根,苦、寒、无毒,具有清热燥湿、杀虫利尿的功效,临床多与其他药物配伍治疗热痢便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹湿疮、皮肤瘙痒、疥癣麻风等,体现了独特的抗氧化、抑菌及抗炎等药理作用,其抗氧化活性成为当前研究的热点之一。研究表明,生物碱和黄酮类化合物是苦参中主要的两大类化学成分。目前的国家药典是以苦参碱(matrine)和氧化苦参碱(oxymatrine)作为其定性和定量指标;另外,药典对临床功效明显不同的山豆根也同样以这两种生物碱作为定性和定量指标。这表明仅以生物碱来评价苦参的整体质量和药效尚不完善,苦参的药效物质基础有待进一步明确。课题组前期研究发现,苦参中黄酮类化合物HPLC指纹图谱可有效区分苦参和山豆根,提示苦参黄酮成分具有较高的专属性。然而目前对苦参专属代表性黄酮成分的分离、提纯等研究较少,市场所售苦参黄酮标准品质量参差不齐且价格较高。如何结合黄酮类化合物抗氧化特性,建立一种更为高效的分离方法是研究苦参黄酮类化合物的关键;同时对苦参黄酮抑菌及抗炎活性的评价有助于完善其对苦参传统功效的贡献。基于以上,本论文拟结合TLC-DPPH、柱层析、重结晶等方法分离苦参中的主要黄酮成分,并通过NMR、UPLC-Q-TOF-MS、HPLC-DAD等技术,建立快速分离苦参黄酮的导向分离及检测方法;采用体外抑菌及体内外抗炎实验,初步评价苦参总黄酮及黄酮类化合物的生物活性。一、基于TLC-DPPH导向跟踪分离的苦参黄酮类化合物的化学成分研究建立了基于TLC-DPPH快速筛选苦参药材抗氧化活性成分的方法,并比较了不同产地苦参抗氧化活性的强弱。采用95%乙醇对苦参药材进行热回流提取,再结合硅藻土-乙酸乙酯法富集得到苦参黄酮部位,并采用TLC-DPPH导向跟踪及各种柱层析方法,建立了苦参中具有抗氧化活性黄酮类化合物的分离方法,成功制备得到12个具抗氧化活性的苦参单体化合物,其中11个化合物经MS和NMR鉴定为:trifolirhizin、nor-anhydroicaritin、calycosin、isoxanthohumol、trifohrhizin-6′-monoacetate、kurarinone、sophoraflavanone G、maackiain、formononetin、8-lavandulyl-5,7,4′-trihydroxy-flavonol、5-methyl-kushenol C。另,KS-12的结构有待进一步确定。其中制备得到苦参中的代表性黄酮化合物kurarinone、sophoraflavanone G的纯品量均达到2 g以上。比较了上述11个单体的抗氧化活性强弱,LODs结果如下:5-methyl-kushenol C(0.06 mM)kurarinone、sophoraflavanone G(0.06 mM)calycosin、isoxanthohumol(0.06 mM)8-lavandulyl-5,7,4′-trihydroxy-flavonol、trifohrhizin-6′-monoacetate、maackiain(0.12mM)nor-anhydroicaritin、formononetin(0.25 mM)trifolirhizin(0.5 mM)。采用UPLC-Q-TOF-MS技术,建立了定性评价苦参中黄酮类成分的方法,并采用HPLC-DAD,建立了定量测定苦参提取物中kurarinone和sophoraflavanone G的方法。二、苦参黄酮类化合物的体外抑菌活性研究采用微量稀释法测MIC值,评价苦参生物碱部位(SA)和苦参黄酮部位(SF)对不同细菌的抑制作用。结果显示:SF对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别是1 mg/mL和0.25 mg/mL;SA的分别是32 mg/mL和8 mg/mL。采用直接TLC-生物自显影-MTT法测LOD值,评价苦参生物碱和黄酮单体对不同细菌LOD值的影响。结果显示:matrine和oxymatrine对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的LOD值均大于4 mM;kurarinone、sophoraflavanone G和5-methyl-kushenol C对金黄色葡萄球菌的LOD值为0.5~1 mM,对大肠埃希菌的LOD值均小于0.5mM。采用纸片扩散法测抑菌圈,评价苦参黄酮单体对不同细菌的抑制作用。结果显示:sophoraflavanone G对受试菌种均有不同程度的抑制作用;kurarinone和maackiain只对革兰氏阳性菌有抑制作用;trifolirhizin对受试菌种均无抑制作用;所选黄酮单体对铜绿假单胞菌均无抑制作用。三、苦参黄酮类化合物的体内外抗炎活性研究以二甲苯致耳廓肿胀小鼠为实验对象,评价SA和SF体内抗炎效果。结果显示:与空白对照组比较,SA低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)和SF低剂量组差异不显著(P0.05);SA高剂量组(200 mg/kg)、SF中剂量组和高剂量组极显著抑制二甲苯致炎小鼠耳廓的肿胀(P0.01),其中SF高剂量组抑制效果最好,抑制率达41.2%。以冰醋酸致腹腔毛细血管通透性增高小鼠为实验对象,评价SA和SF体内抗炎效果。结果显示:与空白对照组比较,SA低剂量组、中剂量组和SF低剂量组差异不显著(P0.05);SF中剂量组有显著差异(P0.05);SA和SF高剂量组有极显著差异(P0.01),其通透性增强抑制率分别为39.9%和50.2%。以角叉菜胶致足肿胀小鼠为实验对象,评价SA和SF体内抗炎效果。结果显示:与空白对照组比较,SA和SF低剂量组致炎后1、2、4、6 h均无显著性差异(P0.05);SA和SF中剂量组致炎后1 h和2 h无显著性差异(P0.05),但4 h和6 h有极显著差异(P0.01),致炎6 h后抑制率分别是52.8%和59.4%;SA和SF高剂量组致炎后1、2、4、6 h都有极显著抑制足跖肿胀的作用(P0.01),致炎6 h后抑制率分别是74.4%和72.0%。且PGE_2检测结果表明,与吲哚美辛组比较,SA和SF高剂量组有极显著差异(P0.01)。以LPS诱导的RAW264.7细胞为实验对象,评价SF和SA体外抗炎效果。结果显示:SF和SA浓度≤100μg/mL时,对细胞无毒性作用(P0.05)。与LPS模型组比较,不同浓度SF药液均呈剂量依赖性抑制NO、TNF-α、IL-6和MCP-1的释放(P0.01);不同浓度SA药液不呈剂量依赖性抑制各炎症因子的释放(P0.05或P0.01)。与SA组比较,SF高剂量组明显抑制各炎症因子的释放(P0.01),表明SF具有显著的抗炎作用。综合以上,本文结合TLC-DPPH、柱层析、重结晶等方法分离单体成分,并通过NMR、UPLC-Q-TOF-MS、HPLC-DAD等技术,建立了快速分离苦参黄酮的导向分离及检测方法;采用体外抑菌及体内外抗炎实验,明确了苦参黄酮对苦参传统功效的贡献。这为苦参黄酮类成分作为苦参质量及药效评价的指标奠定了一定的实验基础,并为合理开发和利用苦参资源提供了新的科学依据。本论文的创新之处:1、建立TLC-DPPH导向跟踪分离苦参黄酮的新方法;2、采用体外抑菌和体内外抗炎方法初步评价了苦参黄酮的生物学活性,并与苦参生物碱的相关活性进行比较,初步证实苦参黄酮对苦参传统功效的贡献。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284.1
【图文】：

不同产地,薄层,抗氧化活性,苦参

广东药科大学硕士研究生毕业论文不同产地苦参抗氧化活性成分的筛选结果LC-DPPH 方法筛选不同产地苦参提取物中抗氧化成分的结果，如图 1-1-1 可知，不同产地苦参提取物产生的抗氧化活性斑点的 Rf值基本一致，要集中于 Rf=0.1 到 Rf=0.8 之间，其中斑点 C、D、H 是稳定存在的抗，可判断不同产地苦参具有相同的主要抗氧化活性成分。

苦参,柱流,薄层层析,回收溶剂

用 8 倍量 95 %乙醇 80℃提取 3 h，滤过，回收溶剂，得含醇量 10 %以下苦参流干，用 8 倍量乙酸乙酯超声提取 2 h，抽并，回收溶剂，蒸干，称重，得苦参 Et酮溶解，加适量 100-200 目柱层析硅胶拌析硅胶，干法装柱，先轻轻掂柱，然后抽法上样，同法排气泡 1 h，再加入保护硅酯甲醇（5:5:1，v/v/v），下口收集 1000条带颜色划分成 24 个小组分并掏柱、晾新合并分类，并用甲醇洗脱，收集流分，分 F10-24 富含抗氧化活性成分。根据显Fr 10-17、Fr 18-19、Fr 20-24），各流分具

【参考文献】