地黄对博来霉素致小鼠肺纤维化防治效果探究

发布时间：2020-06-21 16:59

【摘要】：地黄为我国大宗中药,根据炮制方法不同,其作用上有着较大差异。现代药理学研究发现地黄具有抗老年痴呆、保护胃黏膜、保护心血管系统以及抗肿瘤等多种药理作用。有研究表明地黄在肾纤维化治疗中能发挥积极作用,其机理可能与下调TβRⅠ和Smad2 mRNA表达,同时上调Smad7mRNA表达有关。因此,地黄能否抑制肺间质纤维化值得深入探究。本研究内容包括:1)HPLC测定不同方式提取液中梓醇、益母草苷和毛蕊花糖苷含量,优化药物提取条件。2)通过病理观察,比较得出制备小鼠肺纤维化模型的最佳方案。3)观察地黄防治后模型小鼠肺组织病理变化,比较炎症与纤维化程度,检测胶原蛋白特征指标、肺部氧化损伤指标及致纤维化信号通路相关蛋白,比较地黄不同炮制品对肺间质纤维化作用差异,并探究作用机理。试验一基于HPLC的地黄提取液成分检测使用回流与超声两种方式分别制备干地黄、生地黄和熟地黄药材20%、60%以及100%甲醇溶液提取液,HPLC分别检测提取液中梓醇、益母草苷及毛蕊花糖苷含量,并考察含目标成分最高提取液24h稳定性。结果显示:相同提取方法,随甲醇浓度提高,梓醇、益母草苷以及毛蕊花糖苷等目标成分提取效率明显降低,20%甲醇提取液目标成分含量最高。20%甲醇回流提取,干地黄梓醇提取率15.4mg/g,益母草苷提取率2.1mg/g,毛蕊花糖苷提取率0.4mg/g;生地黄梓醇提取率6.6mg/g,益母草苷提取率0.7mg/g,毛蕊花糖苷提取率0.3mg/g;熟地黄中梓醇提取率0.3mg/g,益母草苷提取率0.1mg/g,毛蕊花糖苷提取率0.2mg/g。20%甲醇超声或回流提取对目标成分提取率影响不大。24h稳定性试验发现:20%甲醇提取液中3种目标成分24h内稳定性良好。提示20%甲醇回流提取1.5h(5次)为制备地黄提取液最佳方案,鲜地黄加工成生地黄和熟地黄后,梓醇、益母草苷和毛蕊花糖苷含量均大幅降低。试验二不同剂量BLM对小鼠肺组织纤维化程度影响研究试验小鼠分为4组,即O组、L组、M组合H组,每组30只。均采用腹腔注射BLM40mg/kg·2d,连续注射4次(L组)、5次(M组)和6次(H组)造模;空白组注射无菌生理盐水。造模开始后每日观察小鼠精神、皮毛、呼吸、运动及死亡等情况。并于试验第21d、28d和35d随机抽取各组存活小鼠,扑杀采集肺脏制作病理切片,用Szapiel方法评价比较不同注射次数不同时期小鼠肺部炎症与纤维化病变程度。结果显示:模型小鼠在试验14～28d间出现死亡,其中L组死亡率0%,M组死亡率30%,H组死亡率50%。存活小鼠病理切片HE染色显示:肺部炎症水平与BLM给药次数呈正相关,并且随着时间的延长炎症逐渐加剧。Masson染色显示:在21d仅有H与M组出现少量病理胶原沉积,而第28d时3模型组均出现明显胶原沉积,但L组仅有少量散在的条索状胶原沉积,M和H组肺组织则出现大面积黏连成片的胶原;至第35d,L组肺纤维化仍在加重,M与H组小鼠肺纤维化程度明显减轻。提示5次腹腔注射BLM 40mg/kg·2d,试验第28d小鼠肺部即出现大量胶原沉积,且该剂量仅有30%的小鼠死亡,可作为小鼠肺间质纤维化造模的推荐方法。试验三地黄防治肺纤维化效果及机理探究将试验小鼠分为空白对照组、模型组、鲜地黄防治组、生地黄防治组和熟地黄防治组,用连续5次腹腔注射BLM40mg/kg·2d造模,试验1～23d每日灌胃给给予相应地黄提取液(原生药2.97g/kg·d),28d扑杀采样,取部分肺脏制作病理切片,评价肺部炎症和纤维化水平;制备肺组织匀浆,检测各组小鼠肺组织羟脯氨酸(碱水解法),测定氧化损伤指标MDA(TBA法)、SOD(WST-1法)和GSH-px(比色法),比较各组小鼠肺组织纤维化水平、氧化损伤程度和抗氧化能力;Western blot法测定TGF-β1/Smads通路蛋白相对表达量。结果显示:干地黄、生地黄和熟地黄均能够不同程度减轻模型小鼠肺部纤维化和炎症,降低肺组织胶原水平。但干地黄提取物对肺纤维化防治效果弱于生地黄和熟地黄提取物。各地黄防治组小鼠与模型组相比肺组织MDA水平极显著降低(P0.01),而GSH-px酶活力显著增高(P0.05),同时SOD酶活力也略有升高(P0.05),说明三种地黄能通过提高GSH-px酶活力而增强肺组织的抗氧化损伤能力,保护肺组织。TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白测定结果显示:生地黄和熟地黄防治组小鼠肺组织TGF-β1蛋白表达较模型组极显著降低(P0.01),Smad2/3蛋白表达明显减少(P0.05),而干地黄差异不显著(P0.05)。3种地黄对TβRⅠ、TβRⅡ、Smad4、Smad6和Smad7蛋白表达均无明显影响。提示生地黄与熟地黄能够有效减轻肺组织损伤和胶原蛋白沉积,抑制肺纤维化发展。结论:20%甲醇回流(1.5h,5次)为地黄最佳提取方案;连续5次腹腔注射BLM 40mg/kg.2d可成功制备小鼠肺间质纤维化模型,28d肺部纤维化病变明显可见。持续给药地黄提取液(原生药7.95g/kg.d)23日,生地黄和熟地黄明显减轻小鼠肺部炎症和肺纤维化水平,其作用机制与增强小鼠抗氧化损伤能力和抑制TGF-β1/Smads通路信号传导作用有关。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

梓醇,洗脱时间

逦谢鑫锋地黄对博来霉素致小鼠肺纤维化防治效果探宄逦１９逡逑精密吸取ｌ0Ｈ丨各供试品在相应条件下进样检测，根据目标峰面积和回归方程进行相应逡逑成分含量计算。逡逑２结果与分析逡逑２．邋１各目标组分洗脱时间逡逑在相应条件下标准品溶液和鲜地黄２０％甲醇回流提取液的ＨＰＬＣ图如下，标准品溶溶逡逑液ＨＰＬＣ图谱可见：梓醇洗脱时间约为ｌＯｍｉｎ（图ｌ－１－ａ），益母草苷洗脱时间约为２７ｍｉｎ３０ｓ逡逑（图ｌ－２－ｃ），毛蕊花糖苷洗脱时间约为１８ｍｉｎ３０ｓ邋（图ｌ－３－ｅ）。在鲜地黄２０％甲醇回流提逡逑取液ＨＰＬＣ可见：ｌＯｍｉｎ的梓醇峰（ｌ－１－ｂ），２７ｍｉｎ３０ｓ的益母草苷峰（ｌ－２－ｄ），１８ｍｉｎ３０ｓ逡逑的毛蕊花糖苷峰（ｌ－３－ｆ）。逡逑■逦＾逦校顺ｒｎ？而ｍ逡逑

标准曲线,鲜地黄,益母草,提取液

图Ｋ３：毛蕊花糖苷ＨＰＬＣ图：标准品图（ｅ），鲜地黄２０％甲醇提取液（ｄ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｕ３邋ＨＰＬＣ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ：邋Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ邋（ｅ），邋Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ邋ｉｎ邋Ｒｅｈｍａｎｎｉａ邋ｒｅｈｍａｎｎｉａ邋（ｆ）逡逑２．邋２精密度试试验逡逑根据各标准品的峰面积计算相应条件下ＲＳＤ邋（ｎ＝６），结果如下：梓醇ＲＳＤ＝１．１０％，逡逑益母草苷ＲＳＤ＝］．６０％，毛蕊花糖苷ＲＳＤ＝１．０７％，表明仪器精密度良好。逡逑２．邋３标准曲线方程逡逑根据标准品检测试验结果计算出各成分回归方程方程，结果如表１－１所示。逡逑表丨－１各标准品标准曲线逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑组别逦回归方程逦ｒ逦线性范围ｎｇ．ｍｌ－１逦逡逑梓醇逦Ｙ＝邋０．０００２Ｘ邋＋邋４．７５８５邋ｒ邋＝邋０．９９９７逦５０－４００逡逑益母草苷逦Ｙ邋＝邋０．０００１Ｘ－邋０．４９６逦ｒ＝１．００００逦１－１５０逡逑毛蕊花糖苷逦Ｙ＝０．００００５Ｘ邋－邋０．４０８Ｓ邋ｒ＝０．９９９９逦０．５－５０逦逦逡逑

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