开窍药对永久性局灶性脑缺血模型大鼠神经血管单元的保护机制研究

发布时间：2020-06-22 18:47

【摘要】：目的:探讨艾片(左旋龙脑)、天然冰片(右旋龙脑)、冰片(合成龙脑)、苏合香、安息香五味开窍药的神经血管单元(NVU)保护作用及其相关机制,以阐释开窍药开窍醒神功效的科学内涵;同时比较五味开窍药的药效强弱,为临床组方选药提供参考。方法:(1)采用线栓法制备永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)大鼠模型,记录各组大鼠从麻醉到苏醒的时间,并参照Longa评分法对大鼠神经功能损伤进行评分。(2)采用干湿重法测定pMCAO模型大鼠脑含水量、脑指数及脑水肿率。(3)采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法对pMCAO模型大鼠脑组织进行染色观察脑组织梗死情况,并测计算脑梗死率。(4)采用苏木精-伊红(HE)染色法观察pMCAO模型大鼠缺血半暗带脑组织细胞形态,并计算神经元变性细胞指数(DCI)。(5)采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定pMCAO模型大鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。(6)采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)法、免疫印迹法(WB)法、免疫组织化学法测定pMCAO大鼠模型缺血半暗带脑组织中Wnt3a、β连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、大肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、紧密连接蛋白5(Claudin-5)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA及蛋白的表达。(7)采用透射电镜观察pMCAO大鼠缺血半暗带脑组织中神经元以及血脑屏障超微结构。结果:(1)三种冰片能显著延长模型大鼠麻醉后苏醒时间(P0.01),苏合香与安息香对苏醒时间无明显影响;艾片与安息香能显著降低模型大鼠术后24 h的神经行为评分(P0.05),天然冰片与冰片有降低行为评分的趋势。(2)艾片、冰片、苏合香、安息香能显著降低模型大鼠缺血侧脑含水量、Δ含水量、Δ脑指数(P0.01);艾片、冰片、安息香能显著降低模型大鼠脑水肿率(P0.01)。(3)TTC染色结果显示,造模后脑组织可见明显的苍白梗死区,开窍药对脑梗死有不同程度的改善作用,艾片、冰片、苏合香、安息香能显著降低模型大鼠脑梗死率(P0.01)。(4)HE染色结果显示,造模后大鼠缺血半暗带脑组织出现明显病理学变化,表现为神经组织坏死、液化,形成筛网状病灶,与周围组织有较明显分界,五味开窍药可不同程度改善脑组织病理学变化。艾片、冰片、苏合香、安息香可显著降低模型大鼠缺血脑组织神经细胞DCI(P0.01)。(5)五味开窍药均能显著升高模型大鼠血清中VEGF的含量,显著降低模型大鼠血清中TNF-α的含量(P0.05或P0.01),对NGF及IL-1β无明显影响。(6)总体来看,开窍药有升高pMCAO模型大鼠缺血半暗带脑组织中Wnt3a蛋白、β-catenin mRNA、Dsh1 mRNA、GSK-3βmRNA与蛋白、Claudin5 mRNA与蛋白、Bax mRNA与蛋白、Bcl-2 mRNA与蛋白表达的作用趋势,有降低Wnt3a mRNA、β-catenin蛋白、LEF1 mRNA、APC mRNA与蛋白、Caspase-3 mRNA与蛋白表达以及Bax与Bcl-2表达比值的作用趋势。(7)透射电镜结果显示,模型组大鼠缺血半暗带脑组织神经元的细胞核溶解、双层核膜结构不连贯、细胞浆内细胞器溶解消失,胞浆呈空泡状,毛细血管壁层次增厚,内皮细胞、基底膜和胶质细胞之间的突起之间的间隙增宽,而五味开窍药能不同程度改善模型大鼠脑组织神经元和BBB的超微结构。结论:五味开窍药有促进pMCAO模型大鼠神经功能恢复、降低脑含水量及脑梗死率、减轻神经细胞损伤的作用,可能是开窍药发挥“开窍醒神”功效的主要药效学基础。五味开窍药的药效作用强弱依次为艾片冰片安息香苏合香天然冰片,提示临床在选用开窍药组方治疗脑缺血相关疾病时首推艾片。开窍药通过调节Wnt/β-catenin信号通路、抑制细胞凋亡、促进微血管新生以及保护BBB而保护神经血管单元,这可能是其综合表达“开窍醒神”的主要生物学机制。五味开窍药的NVU保护机制聚类不同可能与开窍药的寒热药性差异有关。冰片、天然冰片的抑制细胞凋亡可能与其寒凉药性有关,而苏合香与安息香的促微血管新生及保护BBB可能与其温热药性有关。本研究以NVU为切入点探讨开窍药的脑保护作用及机制,研究思路具有中医药整体观特色,研究借助了RT-PCR、免疫印迹及免疫组化等分子生物学手段,并结合了透射电镜等光学成像技术,研究手段具有集成创新,研究结果提示艾片改善脑缺血药效最优,为临床有效合理使用开窍药提供了参考。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

示意图,信号通路,结构示意图,示意图

Wnt/β-catenin信号通路示意

过程图,过程图,吐温,大鼠

吐温+模型组给予同体积 5 %吐温 80 溶液，吐温+CMC+模型组给予同体积 5 %吐温 80+0.2 %羧甲基纤维素钠溶液，其余各给药组给予同体积相应药液（给药剂量见表1），连续灌胃 3 d。末次给药 30 min 后，对大鼠进行 pMCAO 手术，具体方法参照 Zea Longa方法[12]加以改进：大鼠称重后，按体重采用 10 %水合氯醛(0.3 mL／100g)腹腔注射进行麻醉，大鼠翻正反射消失后将其仰卧于手术台，四肢固定。从大鼠颈部正中切开，依次分离左侧颈总动脉（Common carotid artery， CCA）、颈外动脉（External carotid artery，ECA）和颈内动脉（Internal carotid artery， ICA）。然后将 CCA 近心端和 ECA 远心端用手术线结扎。在 ICA 近心端准备手术线，远心端用动脉夹夹闭血管，CCA 切口，插入直径为 0.286mm 的鱼线，松开动脉夹，鱼线向 ICA 插入 18~20mm 进入 ICA，穿过大脑中动脉（Middle cerebral artery，MCA）起始端至大脑前动脉（Anterior cerebral artery，ACA）近端。固定鱼线并记录时间，该时间为大脑局灶性缺血开始的时间。逐层缝合切口，碘伏消毒，回笼饲养并观察。假手术组仅将大鼠皮肤切开并进行血管剥离，但不插入鱼线，其余操作同其它组。

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