仙人掌多糖ODP-Ia初步结构及其促进泡沫细胞胆固醇外流作用研究

发布时间：2020-06-23 11:59

【摘要】：仙人掌是热带与亚热带地区分布极广的野生植物资源,但利用率极低。本实验室前期研究已经明确仙人掌多糖(Opuntia dillenii Haw.polysaccharides,ODPs)具有调节血脂和抗动脉粥样硬化作用,但具体机制尚未明确。本研究的主要目的是优化ODPs提取方法、筛选高活性组分ODP-Ia并明确其结构、阐明ODP-Ia抗动脉粥样硬化的具体分子机制,以促进仙人掌的利用。主要研究结果如下:1.通过响应面实验得到ODPs最佳提取工艺为提取温度93℃,液料比62:1,提取时间3.5 h,由模型预测ODPs得率达到25.14%,验证实验结果为25.05%,与预测值较接近。提取温度为95℃时,多糖含量、DPPH自由基清除率都最高,但多糖中蛋白质含量也最高。随着仙人掌干粉粉碎程度增加,ODPs得率、纯度及对和·OH的清除作用显著增加,300目碎度与粗粉比较,多糖得率、含量及对清除作用分别提高了100%、25%和150%。以上结果说明响应面优化得到的提取工艺有利于提高ODPs得率,95℃的提取温度有利于增加多糖的抗氧化活性。粉碎技术有助于提高仙人掌多糖的释放量并保持其品质及功效活性。2.采用阴离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow和丙烯葡聚糖凝胶Sephacryl S-400分离纯化ODPs获得四个组分ODP-Ia、ODP-Ib、ODP-IIa和ODP-IIb。ODP-Ia、ODP-Ib经紫外光谱扫描证实不含蛋白质和核酸,经Sephacryl S-400凝胶柱层析后证实为纯品。凝胶过滤法测定ODP-Ia和ODP-IIa分子量分别为339 kD和943 kD。红外光谱分析确定ODPs是α-吡喃多糖、ODP-Ia是β-吡喃多糖,ODP-IIa是β-甘露多糖。ODP-Ia对·OH、DPPH·、清除作用最强,其次是ODP-IIa和ODPs。3.成功构建了THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型,ODP-Ia可以显著抑制THP-1巨噬细胞的泡沫化,减少脂质蓄积,同时显著促进泡沫细胞中胆固醇流出,且存在剂量关系。高剂量组15 nmol/L ODP-Ia产生的作用接近于阳性对照依折麦布组。提示ODP-Ia可以通过促进胆固醇逆转运中限速步骤——胆固醇流出以达到促进胆固醇逆转运的作用。4.明确了20 mg/mL apoA-I处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后,胞内胆固醇流出量显著增加,在该条件下,若同时加入ODP-Ia处理,apoA-I介导的泡沫细胞内胆固醇流出量更大,且存在剂量关系。5.ODP-Ia能显著上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中PPARγ、PPARα、LXRα、ABCA1、ABCG1、SR-BI mRNA及蛋白的表达,提示ODP-Ia通过上调这些基因的表达来发挥促进胆固醇流出的作用。6.加入LXRα拮抗剂GGPP或PPARγ拮抗剂GW9662后,ODP-Ia对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的促进作用以及对ABCA1和ABCG1表达的上调作用都显著被抑制。PPARγ拮抗剂GW9662都能同时下调或抑制PPARγ和LXRαmRNA和蛋白质表达。提示PPARγ和LXRα两种核受体存在级联作用,PPARγ-LXRα通路在ODP-Ia促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出过程中发挥调控作用。以上研究结果完善了ODPs提取条件优化的系统性,为制定ODPs的提取规范和质量标准提供了理论依据,并为阐明ODPs降胆固醇作用机制提供新的思路,有利于促进其开发利用。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

胆固醇,影响因子,功能性物质

苷结合盒转运体 G5（ABCG5）、胆固醇 7α 羟化酶表达；祝骥等（2现川穹嗪能降低泡沫细胞内总胆固醇和胆固醇酯，抑制脂质积累，异黄酮则通过诱导 ABCA1 mRNA 和蛋白表达，促进动脉硬化小鼠体胆固醇外排，促进 RCT，进行改善脂质代谢（李培兵等，2014）。这，在众多具有调节胆固醇的功能性物质中，RCT 是普遍存在的机制之径相关的调节因子 RCT 过程包括胆固醇的流出、酯化、转运、摄取和排泄，但普遍认为胞中流出是关键限速步骤。因此，对胆固醇流出环节进行调控的相关关重要。介导巨噬细胞胆固醇流出的三条主要途径中的相关因子包括合盒转运子 A1（ABCA1），它与游离载脂蛋白 apoAI 或前 β-HDL 结合合盒转运子 G1(ABCG1)与比较成熟的 HDL 结合；清道夫受体 B 族receptor class B type， SR-BⅠ)与成熟的 HDL 结合，他们对巨噬细胞胆起着关键作用（Remaley et al., 2011）。

多糖含量,提取温度,响应面分析,结果差异

结果差异不大，当温度上升至 100℃水平时，多糖含量出现了小幅度的下降。所以，选择 80、90、100℃三个水平进行响应面分析。图2-1 提取温度对ODPs多糖含量的影响Figure 2-1 Effect of temperature on the polysaccharides content of crude extracts一般认为，提取温度上升更有利于植物细胞的破碎，使细胞内的多糖溶出量增加。

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