菝葜正丁醇萃取物的纯化及其对RAW264.7巨噬细胞炎症的影响

发布时间：2020-06-24 13:39

【摘要】：本试验通过建立脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型,菝葜正丁醇层及其纯化部位与脂多糖共同干预细胞,研究菝葜的体外抗炎活性,同时进一步探讨其抗炎机制。采用超声辅助醇提法提取菝葜,经石油醚、乙酸乙酯和正丁醇逐级萃取,得到正丁醇萃取层,选择皂苷吸附能力强的D101树脂纯化皂苷,优化纯化工艺得到D5(D101 50%乙醇洗脱层)。选择皂苷吸附能力弱的S-8树脂纯化酚类物质得S3,S5,S7(S-8 30%,50%,70%乙醇洗脱层)。采用MTT法检测细胞相对活力,确定样品的最适浓度。脂多糖体外刺激RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型。通过Elisa法测定细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6,筛选菝葜抗炎活性部位。通过Griess法测试细胞上清液中NO的分泌水平,并运用RT-qPCR检测细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和Caspase-3 mRNA的表达水平。采用蛋白免疫印迹(WB)检测细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bcl-XL、TNF-R1、p-IκBα、p-IKKβ和p-p65的蛋白表达,利用细胞核染料Hochest33342检测凋亡细胞。最后,运用UPLC-DAD-ESI-MS推测抗炎活性部位S5和D5的化学成分及裂解方式。结果如下:(1)选择D101与S-8型大孔树脂分别纯化菝葜正丁醇层皂苷和酚类物质,经纯化后,D101树脂纯化总皂苷含量可达78.47%(D5),S-8型树脂纯化酚类含量最高可达80.26%(S5)。(2)菝葜提取物(正丁醇层,S5,D5)不同程度的降低了RAW264.7巨噬炎症细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌及mRNA的表达水平,同时抑制NO的分泌水平。(3)菝葜抗炎组分不同程度的下调巨噬细胞中NF-κB炎症通路的TNF-R1、p-IκBα、p-IKKβ和p-p65蛋白表达,通过抑制NF-κB通路的激活抑制炎症,且D5的抑制效果最显著。(4)菝葜抗炎组分不同程度的下调巨噬细胞中的促凋亡Caspase-3、和Caspase-9蛋白表达,抑制了Caspase-3的转录,并显著上调了抗凋亡Bcl-XL、和Bcl-2的蛋白表达,且S5的调节作用最为显著。(5)细胞荧光染色试验结果显示,S5与D5都能显著缓解脂多糖引起的细胞凋亡,且S5抗凋亡效果最明显,与蛋白结果相对应。(6)菝葜抗炎组分,D5主要含有伪原薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷;S5成分为香草酸葡萄糖苷、新绿原酸、落新妇苷、槲皮素、山奈酚-3-葡萄糖鼠李糖苷及秦皮甲素。结论:菝葜正丁醇层抗炎活性组分,可能通过抑制NF-κB通路的激活,从而抑制细胞炎症因子的分泌和转录,同时调节凋亡相关蛋白的表达,抑制炎症引起的细胞凋亡,最后达到抗炎的效果。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285
【图文】：

Control 76.61±5.85 67.16±6.54 36.48±LPS 475.67±6.18##499.80±7.36##384.42±1 20μg/mL+LPS 427.35±7.21 473.22±6.32 345.62± 40μg/mL +LPS 394.33±8.39* 210.65±11.17** 245.46±53 20μg/mL+LPS 468.56±6.62 497.62±10.45 376.24±3 40μg/mL+LPS 425.26±7.62 495.85±9.23 386.76±5 20μg/mL+LPS 399.33±7.35* 369.59±9.62** 256.84±75 40μg/mL+LPS 137.22±4.91** 193.12±8.72** 135.68±97 20μg/mL+LPS 469.23±5.38 492.35±7.12 376.24±7 40μg/mL+LPS 465.51±6.18 483.42±8.46 347.56±5 20μg/mL+LPS 318.35±9.19* 252.12±9.18** 215.73±85 40μg/mL+LPS 115.17±3.62** 134.47±10.58** 128.94±1##表示 LPS 组与正常对照组进行比较存在极显著差异，P＜0.01。*表示样品干预与行比较存在显著差异，P＜0.05，**表示样品干预与 LPS 组进行比较存在极显著差0.01。 菝葜正丁醇萃取物对 NO 分泌的影响

如图3-1是菝葜正丁醇层抗炎部位对NO的分泌的影响。与对照组相比，在LPS的诱导下，NO的分泌量显著增加，这是巨噬细胞产生炎症的表现。加入样品干预后，NO的分泌量得到显著的抑制。与LPS组相比，各提取物的40 μg/mL剂量组都能显著抑制NO的分泌。而S5低剂量组20 μg/mL有抑制趋势，没有显著差异，而D5低剂量组20 μg/mL可以显著抑制（P<0.05）。于此结果相吻合，D5 40 μg/mL剂量组相较于S5对NO的抑制作用更为显著，可以与空白组无差异（P<0.01）。3.4 菝葜正丁醇萃取物对炎症细胞形态的影响

【参考文献】

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本文编号：2727929