甲基莲心碱对LPS刺激的共培养条件下血管内皮细胞的保护及机理研究

发布时间：2020-06-24 16:19

【摘要】：目的:作为一种慢性心血管炎症损伤性疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)已成为谋害现代人类健康的主角。研究发现AS的形成和发展主要诱因是由人体内某些微生物感染,造成相关炎性因子分泌增加及急性时相蛋白表达上升,内皮细胞(VECs)结构和功能异常而导致的。细菌脂多糖(lipopolysaccheride,LPS)作为AS感染过程中的炎症启动因子,能依附于血管内皮细胞,随之,内皮细胞(VECs)与平滑肌细胞(SMCs)彼此干预从而引起机体炎性综合症。甲基莲心碱(Neferine,Nef)有调节心律,降低血脂,消炎症,清除氧自由基等抗心血管疾病的药理作用。因此,本实验旨在从细胞水平阐述甲基莲心碱治疗动脉粥样硬化过程中发挥的作用。围绕共培养环境下,SMCs会调控HUVECs的增殖与分泌;LPS刺激人脐血管内皮细胞(HUVECs)炎性损伤的分子机制进行观察;研究Nef对炎性损伤后HUVECs中NF-κB信号通路中蛋白表达影响,探讨Nef防治AS的新靶点及依据。方法:对人脐血管内皮细胞(HUVECs)进行培养,用LPS刺激HUVECs,根据损伤程度筛选出LPS诱导水平;为了模拟体内环境,我们建立间接接触HUVECs-SMCs的共培养系统;通过CCK8测定比较不同浓度的甲基莲心碱对损伤HUVECs细胞的凋亡率的差异;Griess Reagent法用于检测细胞内一氧化氮(NO)的含量;比色法测定细胞内一氧化氮合酶(NOS)分型的活力;流式细胞技术检测甲基莲心碱对诱导损伤后HUVECs细胞损伤情况;采用免疫印迹法(Western blot)检测HUVECs内NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化;ELISA法检测黏附因子TNF-α和细胞间黏附因子-1(ICAM-1)分泌水平,采用实时荧光定量PCR方法检测TNF-α和ICAM-1的mRNA相对表达。结果:LPS刺激HUVECs 24h后,CCK8检测到LPS的浓度为100ug/ml时细胞损伤适中,确定为诱导浓度(P0.05);CCK8检测和流式结果显示Nef能抑制LPS刺激损伤HUVECs的细胞凋亡,并呈一定的浓度依赖性(P0.05);Nef还能显著性逆转共培养前提下LPS诱导的人脐血管内皮细胞中NO含量的增加和总NOS(tNOS)及iNOS的活性的升高(P0.05);Western blot结果显示,在Nef干预LPS刺激损伤的VECs-SMCs共培养体系后,降低了 NF-κB通路中p65的表达,而提高了 IκB-α表达,并且差异具有统计学意义;ELISA法和RT-PCR结果表明,Nef下调了炎性感染中TNF-α和ICAM-1相关因子的分泌和表达,且呈一定的浓度依赖性,P0.05。结论:甲基莲心碱能够逆转LPS诱导的人脐静脉内皮细胞的损伤,调节共培养条件下人脐血管内皮细胞中NO的释放和NOS的活力,并且通过抑制血管内皮细胞NF-κB信号通路,下调TNF-α和ICAM-1等炎性因子的表达,抑制了炎症的发展,达到抗动脉粥样硬化的目的。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

逦甲基莲必碱对ＬＰＳ刺激的共培养条件下血管内皮细胞的保护及机理研巧；逦逡逑高为（１２．６６±０．４０）邋％，差异具有统计学意义，Ｐ＜０．０５，说明甲基莲也碱抑制细逡逑胞损伤在一定浓度范围下呈浓度依赖性，过高浓度的甲基莲屯、碱反而对ＨＵＶＥＣｓ逡逑细胞有损伤。逡逑图３．２流式细胞仪检测各组ＨＵＶＥＣｓ细胞的调亡情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｉｎ邋ＨＵＶＥＣｓ邋ｗｅｒｅ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ逡逑逦

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本文编号：2728095