淫羊藿苷调控Nrf2信号通路对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的作用

发布时间：2020-06-24 22:20

【摘要】：目的:探讨淫羊藿苷(Icariin,ICA)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞损伤的保护作用并明确核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2related factor 2,Nrf2)信号通路在其中所发挥的作用。方法:(1)将BV2细胞(小胶质细胞的细胞株)随机分为空白组、ICA(0.1μM)单独给药组、LPS(1μg/ml)组、LPS+ICA(0.01μM)低剂量组、LPS+ICA(0.1μM)高剂量组。细胞给予ICA作用30 min后再给予LPS处理24 h。通过MTT法检测小胶质细胞的损伤情况;免疫荧光观察小胶质细胞的激活情况和Nrf2的激活情况;通过Real-time PCR检测2 h、6 h、24 h时Nrf2、HO-1和NQO1的m RNA水平;通过Western Blot检测细胞中Iba-1、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达;通过Griess法和ELISA法分别检测细胞上清液中NO、白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18的含量。(2)为了确定Nrf2信号通路在ICA抗神经炎症中发挥的作用,分别通过Nrf2-siRNA(50 n M)沉默Nrf2表达和HO-1特异性抑制剂Zn PP(20μM)抑制HO-1表达,用Western Blot分别检测Nrf2的沉默效率和HO-1的抑制效率;通过免疫荧光观察小胶质细胞的激活情况;通过Real-time PCR分别检测2 h、6 h、24 h时Nrf2、HO-1和NQO1的m RNA水平,Western Blot检测Iba-1、Nrf2、HO-1和NQO1表达;通过Griess试剂盒和ELISA法分别检测上清液中NO、IL-1β和IL-18的含量。结果:(1)MTT结果显示,空白组、ICA(0.1μM)单独给药组、LPS(1μg/ml)组、LPS+ICA(0.01μM)低剂量组和LPS+ICA(0.1μM)高剂量组之间细胞活力无明显变化;Western Blot和免疫荧光结果显示,ICA可以抑制小胶质细胞的激活;Griess试剂盒和ELISA法测得的结果显示与空白组相比,LPS组NO,IL-1β和IL-18的释放量增加,而在给予ICA后明显降低;PCR结果显示LPS可以增加2 h时Nrf2的m RNA水平和6 h时HO-1、NQO1的m RNA水平,给予ICA后,相应时间点的Nrf2、HO-1、NQO1的m RNA水平进一步增加;免疫荧光结果显示与LPS组相比,给予ICA能增加Nrf2的入核;Western Blot结果显示LPS组BV2细胞的细胞核中Nrf2以及HO-1、NQO1的蛋白表达与空白组相比明显升高,在给予ICA后,细胞核中Nrf2和细胞中HO-1、NQO1的蛋白表达进一步升高。(2)Western Blot结果显示用Nrf2-si RNA转染后小胶质细胞中的Nrf2蛋白表达明显下降;MTT结果显示Nrf2-si RNA(50 n M)对小胶质细胞没有细胞毒性;PCR结果显示给予Nrf2-si RNA 6 h后HO-1和NQO1的m RNA水平相对于LPS+ICA(0.1μM)明显降低;Western Blot结果显示Nrf2-si RNA处理后HO-1和NQO1的蛋白表达相对于LPS+ICA(0.1μM)明显降低;免疫荧光结果显示在给予Nrf2-si RNA后,小胶质细胞的激活量相对于LPS+ICA(0.1μM)组明显升高。用Griess法和ELISA测得的结果显示用Nrf2-si RNA处理后,培养基中NO、IL-1β和IL-18的释放量相对于LPS+ICA(0.1μM)组明显升高。(3)Western Blot结果显示HO-1抑制剂Zn PP(20μM)可降低HO-1蛋白表达;MTT结果显示20μM的Zn PP对小胶质细胞没有明显的毒性作用;PCR结果和Western Blot结果显示Zn PP对ICA诱导的Nrf2激活没有显著影响;Western Blot结果和免疫荧光结果提示Zn PP处理后小胶质细胞的激活量相对于LPS+ICA(0.1μM)明显升高;Griess试剂盒和ELISA测得的结果显示在给予Zn PP后,炎症因子的释放量相对于LPS+ICA(0.1μM)组明显升高。结论:ICA可能通过调控Nrf2信号通路抑制小胶质细胞介导的神经炎症。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

小胶质细胞,细胞活力,神经炎,培养基

S 介导的小胶质细胞神经炎症反应0.01μM）和 ICA（0.1μM）预处理小胶质细胞理 24h。通过 MTT 测定细胞活力。如图 1 所示LPS（1μg/ml）组、LPS+ICA（0.01μM）低剂量细胞活力无明显变化。收集细胞总蛋白，通过达。如图 2A 和 2B 所示，与 LPS 组相比，给显降低，说明 ICA 可抑制小胶质细胞激活。随培养基中 NO，IL-1β 和 IL-18 的释放量。如图 3给予 LPS 后，培养基中 NO，IL-1β 和 IL-18 的明显下降。

空白图,小胶质细胞,标准误,空白

图 2 ICA 抑制 LPS 介导的小胶质细胞激活注：数据以均数±标准误( ± SEM，n=3)表示，*P<0.05 vs 空白组,#P<0.05 vs LPS 组。（A）各组细胞Iba-1 免疫荧光代表图片（标尺=100 μm）；（B）各组细胞 Iba-1 代表性条带和含量统计图；Fig. 2 ICAattenuated LPS-induced microglia activation. Results were the mean ± SEM from three independentexperiments performed in triplicate. *P<0.05 compared with the control cultures;#P<0.05 compared with LPS-treatedcultures. (A) Representative photomicrographs of Iba-1 of each group (scale bar = 100 μm); (B) Representative bandsand quantitative analysis of Iba-1 of different groups.图 3 ICA 抑制小胶质细胞炎症因子释放注：数据以均数±标准误( ± SEM，n=3)表示，*P<0.05 vs 空白组,#P<0.05 vs LPS 组。（A）各组细胞上清中 NO 的释放量;（B）各组细胞上清中 NO、IL-1β、IL-18 的释放量；（C）各组细胞上清中 IL-18 的释放x

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