人参皂苷Rg3对TME巨噬细胞极化的调控研究

发布时间：2020-06-24 22:45

【摘要】：背景:癌症严重影响人类的身心健康,其发生发展是多因素长期作用的结果。而慢性炎症则是其中的重要因素之一。1863年,Rudolf Virchow发现肿瘤组织中存在一定量白细胞,由此将炎症与肿瘤联系起来,并提出炎症是肿瘤发生的原因。胃癌(GC)是全球第四常见的恶性肿瘤,同时GC引起的肿瘤性死亡在全世界肿瘤性死亡排第二。我国胃癌患者基数大,因此对于胃癌的治疗任重道远。胃癌与慢性胃炎关系密切,因此,我们是否可以通过应用免疫调节药物,调节胃癌炎性微环境是我们工作的重点。人参皂苷Rg3是人参的提取物之一,具有抗肿瘤活性。目前关于人参皂苷Rg3的抗肿瘤机制研究,大多数集中于其促肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖及阻滞细胞周期等作用上,有文献报道,人参皂苷Rg3可调节树突状细胞(DC)活性,在此基础上,我们考虑人参皂苷Rg3具有免疫调节的潜能。有文献报道,人参皂苷Rg3干预肿瘤细胞后,上清中IFN-γ表达升高,IL-4表达下降,而IFN-γ、IL-4与巨噬细胞的极化密切相关,同时,我们前期工作已经发现人参皂苷Rg3可以抑制肿瘤新生血管形成,已有大量研究表明肿瘤组织中的血管形成与TME中的TAM密切相关,故提出假说,人参皂苷Rg3可能通过调节巨噬细胞极化从而发挥其抗肿瘤功效。我们以巨噬细胞作为研究对象,通过TAM与胃癌细胞株MFC共培养体外模拟胃癌炎性微环境,观察人参皂苷Rg3对巨噬细胞极化的影响;利用胃癌腹腔转移瘤小鼠模型,探究人参皂苷Rg3能否通过其免疫调节作用改变胃癌炎性微环境,达到抑制肿瘤发展的目的。目的:1、确定人参皂苷Rg3对MFC细胞活力的直接影响。2、观察人参皂苷Rg3能否诱导巨噬细胞向M1极化。3、动物试验观察人参皂苷Rg3在体内抗肿瘤活性及对肿瘤组织中巨噬细胞极化的影响。方法:1、CCK-8实验:培养MFC细胞,接种96孔板,用以下浓度人参皂苷Rg3干预MFC细胞:25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。分别于干预24、48h后用CCK8试剂检测细胞活性。2、用条件培养液体外模拟胃癌微环境:用0μg/ml、25μg/m、50μg/ml、100μg/ml的人参皂苷Rg3溶液处理MFC细胞,48h后弃上清,更换为无血清DMEM细胞培养液,24h后收集各孔上清培养液并加入预先培养好的小鼠巨噬细胞RAW264.7中,再分别收集RAW264.7细胞和上清,细胞提取RNA和蛋白,RNA用于RT-PCR实验,检测RAW264.7细胞中iNOS、IL-12、IL-10的表达量;用Western blot法检测iNOS、IL-12、Arg-1蛋白的表达水平。3、建立615小鼠腹腔转移瘤模型:选择合适的腹腔灌注细胞数后,予以荷瘤,设立control组(空白组)、Rg3组、5Fu组、Rg3+5Fu组(联合组),在腹腔转移瘤模型建立成功后,给与相应药物干预,观察小鼠生存时间,取小鼠眼眶血、腹腔积液做后续ELISA实验,取腹腔肿瘤标本做免疫组化。结果:1、人参皂苷Rg3干预MFC细胞后,细胞活力降低,Rg3浓度越高,细胞活力越低。2、RT-PCR实验表明,不同浓度人参皂苷Rg3作用MFC细胞所得条件培养液处理RAW264.7细胞后,MFC CM(未用药物干预的条件培养基)处理组同IL-4处理组iNOS、IL-12、IL-10表达量相仿;其余组RAW264.7细胞的iNOS、IL-12表达量随着人参皂苷Rg3浓度的增加也逐步增加;而IL-10的表达随着人参皂苷Rg3浓度的增加逐渐降低。Western blot实验提示,不同浓度人参皂苷Rg3作用MFC细胞所得条件培养液处理RAW264.7细胞后,随着人参皂苷Rg3浓度的增加,所得到的条件培养液处理RAW264.7细胞后,其iNOS和IL12的表达呈上升趋势,而Arg1表达则呈下降趋势。3、Rg3组与control组相比较,两组肿瘤组织中CD68阳性比例接近,而Rg3组CD11c阳性比例明显增高、CD206的阳性比例明显降低;将联合组同5Fu组进行对比,可见两组肿瘤组织中CD68阳性比例接近,联合组CD11c阳性比例明显增高、而CD206的阳性比例明显降低;将5-Fu同control组对比,二者CD68、CD11c、CD206阳性比例均相仿。提示人参皂苷可诱导TME巨噬细胞向M1型巨噬细胞发生极化,抑制巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞。Rg3可延长小鼠生存时间,但其效果不如5Fu,联合治疗具有协同作用,可进一步延长小鼠生存时间。结论:人参皂苷Rg3在体外可抑制MFC细胞增殖,且具有剂量依赖性,体内具有抗肿瘤活性。细胞实验及动物实验均提示其机制可能与Rg3诱导巨噬细胞向M1极化,改善胃癌炎性微环境相关。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

实验结果一、CCK-8实验结果图1 不同浓度人参皂苷Rg3作用下MFC细胞活力（n=3）图1中不同浓度Rg3处理组分别与空白对照组进行两两对比，可以看出不同浓度Rg3作用MFC细胞后，MFC细胞活力均下降。同时我们可以看出在作用相同时间的条件下，随着人参皂苷Rg3浓度的不断增加，MFC细胞活力逐渐下降。由此提示，人 参 皂 苷 Rg3 对 MFC 细 胞 活 性 的 影 响 具 有 剂 量 依 赖 性 。 (*p<0.05 ， **p<0.01,***p<0.001)。二、RT-PCR实验图2 IL-4及各条件培

图1 不同浓度人参皂苷Rg3作用下MFC细胞活力（n=3）图1中不同浓度Rg3处理组分别与空白对照组进行两两对比，可以看出不同浓度Rg3作用MFC细胞后，MFC细胞活力均下降。同时我们可以看出在作用相同时间的条件下，随着人参皂苷Rg3浓度的不断增加，MFC细胞活力逐渐下降。由此提示，人 参 皂 苷 Rg3 对 MFC 细 胞 活 性 的 影 响 具 有 剂 量 依 赖 性 。 (*p<0.05 ， **p<0.01,***p<0.001)。二、RT-PCR实验

【参考文献】

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本文编号：2728464