肝豆汤对高铜诱导的HT-22细胞线粒体自噬效应及其作用机制的研究

发布时间：2020-06-27 23:18

【摘要】：Wilson’s病(Wilson’s Disease,WD)是一种由于位于13号染色体上的ATP7B基因突变,造成铜代谢障碍的常染色体隐性遗传性疾病。该病病情复杂多变,故临床上可将其分为潜伏型(症状前期型)、脑型、内脏型、脑内脏型等等,其中以脑型患者最为多见,约占患者总数的60%左右。脑型WD患者临床表现以运动障碍、精神障碍以及帕金森综合征等为主,其临床表现与铜离子沉积于脑内,导致海马、基底节区等相关认知区域受累密切相关。前期研究发现铜负荷大鼠的学习记忆能力受损可能与其丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在高铜诱导下活化从而损伤海马相关神经元有关。故本实验选取小鼠海马神经元细胞(HT-22)进行相关研究。因此,研究高铜诱导的海马神经元细胞损伤机制及其可能的干预途径,对于临床脑型WD患者的诊治具有重要的意义。铜在细胞内的大量蓄积会促使活性氧(ROS)的大量释放,导致细胞产生氧化应激反应,从而诱导细胞自噬的发生。传统西药如青霉胺、二巯基丙磺酸钠等治疗WD,虽驱铜效果较好但不良反应大,甚至可能会导致神经精神症状进一步恶化,严重影响了WD患者的病情与预后。笔者所在单位经多年研究,首提清热解毒、通腑利湿之治法治疗WD,并组方肝豆汤治疗该病,临床效果显著。前期研究发现肝豆汤可以下调TX小鼠脑内ASM、Cer、NK等相关蛋白的表达,从而恢复TX小鼠的脑部损伤症状。但目前这些研究尚不能完全阐明肝豆汤对高铜诱导神经元损伤的具体疗效机制。高铜可诱导神经元发生氧化应激反应,从而造成神经元细胞大量自噬性死亡。因此我们假设肝豆汤通过调控线粒体自噬相关蛋白来阻断高铜诱导所造成的线粒体自噬现象,从而缓解神经元损伤,达到保护神经元的作用,改善WD患者的脑损伤症状。目的:研究肝豆汤对高铜诱导的HT-22细胞线粒体自噬效应及其可能的作用机制,为中医药诊治脑型WD患者提供新的治疗靶点和研究思路。方法:(1)采用MTT比色法检测在不同的时间节点下,不同剂量的CuSO_4作用于HT-22细胞对其细胞存活率的影响,筛选CuSO_4造模浓度及时间,模拟WD的细胞模型。(2)采用乳酸脱氢酶LDH释放实验检测HT-22细胞LDH漏出。(3)采用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探针法经流式细胞仪检测HT-22细胞中ROS的含量。(4)采用荧光染料JC-1经流式细胞仪检测HT-22细胞线粒体膜电位。(5)采用透射电镜法观察HT-22细胞形态学变化。(6)采用Western Blot法检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表达。结果:(1)MTT结果显示:CuSO_4对HT-22细胞的损伤跟药量和时间呈现一定的正相关性。随着CuSO_4作用剂量或时间的增加,HT-22细胞的存活率呈现出下降趋势。(2)MTT结果显示:CuSO_4作用细胞后LDH漏出率显著增加(P0.01),肝豆汤血清可以降低经CuSO4诱导后HT-22细胞的LDH漏出率(P0.01,P0.05)。(3)流式细胞仪结果显示:经DCFH-DA荧光染色后,发现CuSO_4可显著增加HT-22细胞内ROS生成(P0.01),肝豆汤血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞内ROS产生(P0.01,P0.05)。(4)流式细胞仪结果显示:经JC-1染色后,发现CuSO_4诱导HT-22细胞线粒体膜电位显著降低(P0.01),10%和15%肝豆汤血清可抑制CuSO_4诱导的线粒体膜电位降低(P0.01)。(5)透射电镜结果显示:正常组细胞内线粒体形态完整,大小正常,在细胞内正常分布;自噬体则数量较少。模型组细胞内线粒体数目明显减少,且结构紊乱多空泡化,部分空泡内可见内容物,部分线粒体被包裹进囊泡中;自噬体较大,数量亦明显增多。肝豆汤组细胞内可见少量空泡,线粒体形态结构均接近于正常状态;自噬体较模型组明显减少。(6)Western blot结果显示:与正常组对比,模型组细胞内PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L蛋白的表达显著增加(P0.01)。与模型组对比,肝豆汤血清组Parkin、LC3 A/B、BNIP3L蛋白表达均显著降低(P0.01)。与模型组相比,10%和15%肝豆汤血清组PINK1蛋白表达显著降低(P0.01)。结论:高铜可通过诱导HT-22细胞内线粒体氧化应激,上调自噬相关蛋白及基因PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表达,导致HT-22细胞发生自噬性死亡,而肝豆汤可抑制高铜诱导的HT-22细胞线粒体氧化应激,下调自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表达,抑制线粒体自噬的发生,从而阻断高铜诱导的神经元损伤,达到保护神经的作用。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

验结果uSO4造模浓度的筛选MTT 结果显示：CuSO4对 HT-22 细胞具有损伤作用，且损伤程度与药量和时现一定的相关性，随着 CuSO4作用剂量的增加或作用时间的延长，HT-22 细活率呈现出下降的趋势。实验数据表明，HT-22 细胞经 250μmol CuSO4作用，存活率接近 IC50，因此选择该浓度的 CuSO4作为 HT-22 细胞 24h 造模浓见图 1）

降低其 LDH 漏出（见表 1，图 2）表 1 肝豆汤对 CuSO4损伤 HT-22 细胞 LDH 漏出的影响（ x±s,n=3）Tan.1 Effect of GDT on LDH Leakage in HT-22 Cells injured by CuSO4（ x±s,n=3）组别 例数（n） LDH t p正常组 3 192.33±21.22模型组 3 397.00±16.37 -17.353 0.0005%肝豆汤组 3 352.67±12.58 3.719 0.02010%肝豆汤组 3 309.00±15.62 6.736 0.00315%肝豆汤组 3 318.00±18.00 5.624 0.005

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本文编号：2732238