丹参酮ⅡA对高糖环境中人视网膜血管内皮细胞体外生物学作用的研究

发布时间：2020-06-28 04:23

【摘要】：目的:糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)作为糖尿病最常见和最严重的并发症,危害较大。本研究以人视网膜血管内皮细胞(Human retinal endothelial cells,HRECs)作为研究对象,通过体外实验,在细胞水平研究高葡萄糖环境对HRECs的增殖、迁移和血管成形能力等生物学作用的影响;比较丹参酮IIA(Tanshinone IIA,TSA)对正常葡萄糖环境和高糖环境中HRECs增殖的影响;以及TSA在高糖环境中对HRECs迁移和血管成形能力等生物学作用的影响;进一步检测TSA对高糖环境中HRECs中的VEGF和ICAM-1二个重要分子的转录与表达的影响,以探讨TSA防治糖尿病视网膜病变的可能及相关机制。方法:1、利用CCK8法,分别检测在正常葡萄糖(Normal glucose,NG)和高葡萄糖(High glucose,HG)环境下,不同药物浓度、不同作用时间下,丹参酮IIA(TSA)药物对HRECs的增殖能力的影响。所设立的TSA药物浓度梯度为10、20、30μg/ml,CCK8检测的时间点分别为24 h、48 h、72 h;2、利用细胞划痕实验和transwell实验检测在高糖环境中,不同浓度TSA药物对HRECs的迁移能力的影响。划痕实验中应用倒置荧光显微镜记录0 h、24 h、48 h的伤口愈合情况;transwell实验记录药物作用24 h后迁移的细胞数量;3、利用体外血管成形实验,比较在高糖环境中不同浓度TSA药物作用下,各组细胞成管化情况,以此获知TSA对HRECs血管成形的影响;4、采用q RT-PCR、Western blot和Immunofluorescence技术,分析在高糖环境中,不同浓度TSA药物作用下,HRECs中的VEGF和ICAM-1的m RNA及蛋白水平表达的变化;5、所有数据均用SPSS 13.0软件行统计分析。定量数据以均数±标准差(x±s)表示,主要采用两组数据的独立样本t检验和多组数据的单因素方差分析(One-way ANOVA),对于连续测量数据,采用了重复测量数据的方差分析方法。组间两两比较采用LSD方法比较。P0.05认为差异有显著性意义。结果:1、CCK8法实验中,高糖环境的刺激促进HRECs的增殖;在正常葡萄糖浓度下,HRECs的增殖能力不受TSA药物的影响;在高糖环境中,HRECs的增殖能力受到TSA的抑制,并呈现时间剂量浓度依赖性,随着TSA浓度的增加、作用时间的延长,TSA抑制细胞增殖的能力逐渐加强。在作用72 h,TSA高浓度组(HG-30组)细胞增殖受到抑制最明显;2、划痕实验和transwell实验结果一致:相对于正常葡萄糖环境,高糖环境促进HRECs的迁移;在高糖环境中,TSA抑制HRECs的迁移,并呈现剂量浓度依赖性,TSA高浓度组(HG-30组)抑制迁移的能力最明显;3、体外成管实验显示,与正常葡萄糖环境相比,高糖环境中HRECs的成管能力数量和大小均较强;但在高糖环境中,TSA对HRECs的成管能力有抑制作用,并呈现剂量浓度依赖性,TSA高浓度组(HG-30组)抑制血管成形的能力最明显;4、q RT-PCR、Western blot和Immunofluorescence实验结果显示:与正常葡萄糖浓度环境相比,在高糖环境中HRECs的VEGF及ICAM-1的转录与表达增强;但在高糖环境中,TSA会明显下调VEGF的m RNA及蛋白水平的表达,并呈现剂量浓度依赖性;TSA会明显降低ICAM-1的蛋白水平的表达,并呈现剂量浓度依赖性。TSA高浓度组(HG-30组)抑制VEGF及ICAM-1的转录及表达的效果最显著。结论:1、在高糖环境中,与正常葡萄糖环境相比,HRECs的增殖、迁移和成管能力均有一定的促进作用;2、TSA对高糖环境中培养的HRECs的增殖能力有一定的抑制作用,并呈现时间剂量浓度依赖性;对HRECs的迁移和成管能力有一定的抑制作用,并呈现剂量浓度依赖关系;而TSA对正常葡萄糖环境中培养的HRECs的增殖能力无明显抑制作用;3、在高糖环境中,HRECs的VEGF和ICAM-1的m RNA及蛋白表达增多;而TSA能显著抑制高糖环境中HRECs的VEGF和ICAM-1的m RNA及蛋白表达,且呈现剂量浓度依赖关系。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

细胞增殖,视细胞,丹参酮,重复测量

分丹参酮 IIA 对高糖环境中人视网膜血管内皮细胞体外生物学作用经重复测量的统计学检验，结果表明：在正常葡萄糖环境下，不同浓度 TSA 对人视细胞的增殖无明显抑制作用，差异无统计学意义（*，P > 0.05）。细胞在同一药物间作用下（24 h，48 h，72 h），细胞增殖逐渐增加，组间比较差异有统计学意义（&，P <同一时间作用下，不同药物浓度（10μg/ml，20μg/ml，30 μg/ml）对细胞增殖无影差异无统计学意义（＃，P >0.05）。

葡萄糖,环境,浓度,迁移能力

2. 正常浓度葡萄糖环境和高浓度葡萄糖环境下，NG-0 组与 HG-0 组的 HRECs 细比较。随着时间的延长，高浓度葡萄糖培养下的细胞其增殖能力明显高于正常浓度的细胞，差异有显著统计学意义（**P<0.01）。高糖能够明显促进 HRECs 细胞的增2. TSA 抑制高糖诱导的 HRECs 迁移细胞划痕试验用于观察 TSA 对高糖浓度下 HRECs 的迁移能力的影响。首匀铺板于六孔板，待细胞完全生长铺满孔板底部后，开始实验。细胞提前随后开始划痕，分别在 0、24 和 48 h 拍照记录，分析伤口愈合情况。结果表G-TSA 0 和 NG-TSA 0 两组对比，随着时间的进展，高糖组细胞的划痕面积，伤口愈合面积增大，表明在高糖环境的刺激下，HRECs 的迁移能力变强然而，TSA 药物的加入会显著抑制高葡萄糖诱导的 HRECs 迁移能力，药物浓度依赖性。在 24h 和 48h 拍照记录，发现高浓度的 TSA 组伤口愈低浓度的 TSA 组，提示 TSA 药物浓度越高，该条件下的细胞迁移能力受到显（图 2a 和 b），差异有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01）。

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