基于微流控芯片技术的仙鹤草抗肝肿瘤药效物质及初步作用机制研究

发布时间：2020-06-30 15:53

【摘要】：目的:本文基于微流控芯片技术筛选出鹤草药材药效物质组分,并优化仙鹤草药材药效物质组分的提取纯化工艺,同时建立仙鹤草药材药效物质组分的相关质量标准,在此基础上开展仙鹤草药材药效物质组分体外抗肝肿瘤药效及作用机制研究,为中药抗肺肿瘤新药的开发提供一定的实验参考。方法:1.基于微流控芯片技术,采用Hoechst 33342/PI荧光双染法,以细胞凋亡坏死率为考察指标进行仙鹤草药材药效物质组分筛选研究;以乙醇体积分数、料液比、提取时间为考察因素,总黄酮为评价指标,优化提取工艺条件;以树脂型号、上样浓度、上样液pH值、洗脱溶剂用量等为考察因素,总黄酮为评价指标,优化纯化工艺条件。2.采用HPLC法结合多波长融合技术建立9种不同产地仙鹤草药材药效物质指纹图谱,并采用液质联用技术对仙鹤草药材药效物质组分的成分进行解析,并采用高效液相色谱法对其中主要成分进行多指标成分定量研究,建立仙鹤草药材药效物质组分综合、全面、有效的质量评价体系。3.采用微流控芯片技术、流式细胞术对仙鹤草药材药效物质组分作用后肝癌细胞株HepG2细胞周期、细胞凋亡坏死、迁移及侵袭进行研究,综合评价其抗肝肿瘤药效。4.采用实时荧光定量PCR和Western Blot相关技术,分别从基因及蛋白质水平探讨仙鹤草药材药效物质组分抗肝肿瘤的初步作用机制。结果:1.设计制作了一种多功能的高通量药物筛选芯片,基于微流控芯片技术仙鹤草黄酮类、鞣质类、生物碱、多糖显示不同程度的体外抗肝癌作用:仙鹤草黄酮仙鹤草鞣质仙鹤草生物碱仙鹤草多糖,药效物质组分仙鹤草总黄酮最佳提取工艺条件为1:16倍60%乙醇提取2次,每次1.5 h,总黄酮得率达10.68%,纯度达46.13%;最佳纯化工艺条件为采用D101型大孔吸附树脂,以pH为5、0.2 mg/mL生药浓度上样,上样量为0.6 g/mL(药材/湿树脂),上样体积流量为2 BV/h上样,4 BV水除,8 BV的60%乙醇2 BV/h体积流量进行洗脱,总黄酮得率达4.19%,纯度达91.71%。2.9种不同产地的仙鹤草黄酮类组分之间存在一定差异,共分析鉴定出其10个化合物:槲皮素、山奈酚、槲皮苷、花旗松素、异槲皮苷、紫云英苷、儿茶素、芹菜素、野黄芩苷、鞣花酸,同时多指标成分测定结果显示不同产地的仙鹤草药材黄酮化学成分含量差异较大,其中异槲皮苷含量最高的为江苏常州,0.5386 mg·g~(-1);野黄芩苷含量最高的为安徽亳州,0.8316 mg·g~(-1);槲皮苷含量最高的为广西南宁,0.4152 mg·g~(-1)。3.仙鹤草总黄酮类组分对人肝癌细胞HepG2具有显著促进肿瘤细胞凋亡坏死作用,0.75 mg·mL~(-1)细胞凋亡坏死率达(67.97±1.9)%,对HepG2细胞周期具有显著G2/M阻滞作用,同时基于设计制作的肿瘤细胞迁移侵袭模型芯片,仙鹤草总黄酮类组分对HepG2细胞迁移侵袭显示显著抑制作用,且随着给药剂量的增加,药效逐渐增强,表现出较强抗肝肿瘤作用。4.PCR检测结果显示:仙鹤草总黄酮能显著上调PTEN、Caspase-3、Caspase-9基因的表达,显著下调PI3K、AKT、CyclinB1、CDC2、COX-2、VEGF基因的表达,Western Blot检测结果显示:仙鹤草总黄酮显著降低了PI3K、AKT、VEGF、COX-2、CyclinB1蛋白的表达,显著升高了PTEN、Caspase-9蛋白的表达,整合基因组学、蛋白组学的相关数据,分析仙鹤草总黄酮通过调节PTEN-PI3K/AKT信号通路发挥抗肝肿瘤药效。结论:1.本课题结合软光刻、模注法及等离子键合等技术构建了两种药效研究芯片,一种为多功能的高通量药物筛选芯片,可实现同种细胞多种药物药效的在线筛选,另一种为肿瘤细胞迁移侵袭模型芯片,实现肿瘤细胞迁移、侵袭模型,为下一步仙鹤草药效物质抗肝肿瘤研究奠定基础,也为抗肿瘤药物药效研究提供新的技术平台。2.本课题优化了了仙鹤草总黄酮的提取纯化方法,其工艺简单易于操作,为仙鹤草总黄酮的后续药效研究奠定了一定基础。3.本实验从仙鹤草总黄酮的指纹图谱、成分分析及多指标成分的定量多个角度出发,采用HPLC及UPLC-Q-TOF-MS技术相结合,建立仙鹤草总黄酮综合、全面、有效的质量评价体系,为其开发利用及药效研究奠定实验基础。4.仙鹤草总黄酮具有抑制HepG2细胞增殖、促进HepG2细胞凋亡、阻滞HepG2细胞周期、抑制HepG2细胞迁移侵袭的作用,具有显著抗肝肿瘤药效。5.仙鹤草总黄酮通过调节PTEN-PI3K/AKT信号通路发挥抗肝肿瘤药效。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

辽宁中医药大学 2019 届硕士学位论文72 个细胞培养腔，均匀分布六组，每组有 3 个复列，每列四个细胞培养腔，细胞培养腔由一条对应的通道而连接。通过对该芯片中设计的不同位置入口的不同打孔方式，实现不同的液体流动方式，可实现 6 种不同药物或 6 种细胞药效的在线筛选。

基于微流控芯片技术的仙鹤草抗肝肿瘤药效物质及初步作用机制研究亡坏死率，细胞凋亡坏死率%=（凋亡细胞数+坏死细胞数）/全部细胞数×100%，结果见表 1-2-1、图 1-2-1。表 1-2-1 不同组分对 HepG2 细胞凋亡坏死率的影响（x±s，n=3)组别 细胞凋亡坏死率（%)空白 1.02±0.20仙鹤草黄酮 59.77±0.41**仙鹤草鞣质 52.39±0.79**仙鹤草生物碱 41.35±0.34**仙鹤草多糖 32.68±0.95**注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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本文编号：2735506