LncRNA-ncRuPAR对胃癌的调控机制及滋阴化痰方的干预作用

发布时间：2020-06-30 18:09

【摘要】：研究目的:课题组前期发现lncRNA-ncRuPAR在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,且与胃癌的浸润程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤的大小及TNM分期密切相关,临床有效方药“滋阴化痰方”可抑制胃癌细胞增殖。本课题旨在通过一系列体内外实验探究ncRuPAR与胃癌增殖、侵袭、转移、凋亡的关系及其可能的作用机制,并验证“滋阴化痰方”是否通过干预ncRuPAR发挥其对胃癌的治疗作用,以期深化对胃癌发病分子机制的认识,并为阐释滋阴化痰方可能的作用机制提供数据支持。研究方法:(1)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qPCR)技术检测AGS,HGC27,MKN45,MGC8034株胃癌细胞中ncRuPAR的表达水平。(2)重组慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分别感染HGC27细胞,构建HGC27过表达细胞株HGC27-ncRuPAR及对照细胞株HGC27-Empty Vector;重组慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分别感染MGC803细胞构建MGC803干扰细胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及对照细胞株MGC803-Empty Vector,嘌呤霉素2μg/mL筛选72h后形成慢病毒感染表达稳定株,qPCR检测各稳株中ncRuPAR的表达量。(3)CCK-8法检测ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803增殖的影响;流式细胞计数仪分析ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;细胞划痕实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803迁移能力的影响;Transwell实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803侵袭能力的影响。(4)将HGC27-ncRuPAR,HGC27-Empty Vector及HGC27-Control细胞株分别在裸鼠皮下接种造HGC27皮下移植瘤模型,观察各组裸鼠一般情况及比较瘤体体积和质量,比较ncRuPAR对HGC27皮下移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。(5)Affymetrix基因表达谱芯片技术筛选HGC27-ncRuPAR细胞株和HGC27-Empty Vector细胞株之间差异表达基因,并将芯片分析的差异基因结果进行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis,IPA)分析,推测ncRuPAR影响胃癌细胞增殖凋亡的可能通路;Western blot实验检测ncRuPAR对HGC27和MGC803细胞中PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响。(6)中药“滋阴化痰方”干预HGC27和MGC803细胞株,CCK-8法检测细胞增殖变化,观察滋阴化痰方对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞计数仪分析滋阴化痰方对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;qPCR检测滋阴化痰方对胃癌细胞ncRuPAR表达的影响,观察滋阴化痰方是否对ncRuPAR的表达存在调控作用;Western blot验证滋阴化痰方对PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响,探究滋阴化痰方可能的作用机制。结果:(1)qPCR结果显示:ncRuPAR在HGC27细胞中低表达,在MGC803细胞中高表达。(2)选择HGC27细胞构建ncRuPAR过表达稳定株,选用MGC803细胞构建ncRuPAR干扰稳定株,qPCR验证ncRuPAR过表达及干扰稳株构建成功。(3)CCK-8和流式细胞周期结果显示:过表达ncRuPAR可抑制HGC27细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进其凋亡,而干扰ncRuPAR表达则抑制MGC803细胞增殖、减少细胞凋亡。划痕实验和transwells实验结果显示:ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803的迁移及侵袭能力影响不显著。(4)体内实验中,HGC27-ncRuPAR组与对照组相比,实验组裸鼠成瘤减慢,瘤体减小。(5)Western blot结果显示:过表达ncRuPAR使HGC27细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达下降;而干扰ncRuPAR则可使MGC803细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达升高。(6)中药“滋阴化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803细胞,CCK-8和流式细胞周期结果显示:中药“滋阴化痰方”可以抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡;qPCR结果显示滋阴化痰方可以增加胃癌细胞中ncRuPAR的表达;Western blot结果显示滋阴化痰方可以抑制PI3K、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结论:ncRuPAR可通过下调PAR-1的表达和抑制PI3K/Akt通路发挥其抑制胃癌细胞增殖及促凋亡作用。上调ncRuPAR的表达和抑制PI3K/Akt通路是中药“滋阴化痰方”抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的可能分子机制之一。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

1 四种胃癌细胞中 ncRuPAR 表达柱状图（nuPAR 过表达/干扰稳定株的构建RUPAR（15034-1）和 LV-NCRUPAR-CON 分cRuPAR组与HGC27-Empty Vector组；慢病毒V-NCRUPAR-RNAi-CON 分 别 感 染 MGC8-RNAi 组和 MGC803-Empty Vector 组。两个和 MGC803-Control 组。嘌呤霉素 2μg/mL 筛PAR 的表达量，结果显示：HGC27-ncRuPARmpty-Vector 组和 HGC27-Control 组，差异具RuPAR 细胞中 ncRuPAR 表达量低于 MGC8，差异具有统计学意义（p＜0.05）（图 2），说株构建成功。

图 1 四种胃癌细胞中 ncRuPAR 表达柱状图（n=3）（二）ncRuPAR 过表达/干扰稳定株的构建慢病毒 LV-NCRUPAR（15034-1）和 LV-NCRUPAR-CON 分别感染 HGC27 细记为HGC27-ncRuPAR组与HGC27-Empty Vector组；慢病毒LV-NCRUPAR-R4387-1 ） 和 LV-NCRUPAR-RNAi-CON 分 别 感 染 MGC803 细 胞 并 标 记C803-ncRuPAR-RNAi 组和 MGC803-Empty Vector 组。两个空白对照组分别标GC27-Control 组和 MGC803-Control 组。嘌呤霉素 2μg/mL 筛选后，qPCR 分别组细胞中 ncRuPAR 的表达量，结果显示：HGC27-ncRuPAR 细胞中 ncRuPAR高于 HGC27-Empty-Vector 组和 HGC27-Control 组，差异具有统计学意义（）；MGC803-ncRuPAR 细胞中 ncRuPAR 表达量低于 MGC803-EmptyVector 组C803-Control 组，差异具有统计学意义（p＜0.05）（图 2），说明 HGC27 过表达C803 干扰稳定株构建成功。

【参考文献】

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本文编号：2735645