淫羊藿苷对6-OHDA诱导的帕金森病小鼠模型的保护作用及机制研究

发布时间：2020-07-01 06:17

【摘要】：目的:研究淫羊藿苷(Icariin,ICA)对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用,并探讨其机制是否与调节Nrf2信号通路有关。方法:1、动物实验:采用雄性野生型和Nrf2基因敲除型小鼠,随机分为空白组,ICA(60 mg/kg)组,6-OHDA(4μg)组和6-OHDA+ICA组。采用单侧注射6-OHDA于中脑黑质(substantia nigra,SN)中制备多巴胺(dopamine,DA)能神经元损伤的模型,小鼠于造模前3天开始灌胃ICA,造模后连续灌胃7天,每天一次。通过转棒实验和旷场实验观察小鼠的运动能力;冰冻切片免疫荧光和Western blotting分析DA能神经元特异性标记物-酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、小胶质细胞特异性标记物-离子钙结合蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1,Iba-1)和星形胶质细胞特异性标记物-胶质细胞原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)的表达;UHPLC检测小鼠纹状体内DA及其代谢物的含量;real-time RT-PCR和Western blotting观察中脑核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor2,Nrf2)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)及NADPH醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表达;Western blotting检测中脑炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达;Western blotting检测神经营养因子,如胶质细胞源性神经营养因子(glia cells line-derived neurotrophic factor,GDNF)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达。2、细胞实验:采用原代神经元-胶质细胞共培养和原代神经元培养体系,细胞随机分为空白组,ICA(0.1μM)组,6-OHDA(40μM)组和6-OHDA+ICA组。细胞用ICA预处理30 min后加入6-OHDA。7天后用Western blotting检测两种培养体系中TH蛋白的表达。为进一步研究胶质细胞中的Nrf2是否参与ICA介导的DA神经保护,原代胶质细胞接种于Transwells,加入Nrf2 siRNA处理24 h后,将Transwells转入种有原代神经元的培养板中,重组的神经元-胶质细胞共培养分组为:空白组,control-siRNA(40 nmol/L)组,Nrf2-siRNA(40 nmol/L)组,ICA(0.1μM)组,6-OHDA(40μM)组,6-OHDA+ICA组和6-OHDA+ICA+Nrf2-siRNA组。细胞用ICA预处理30 min后加入6-OHDA。7天后用免疫荧光和Western blotting检测DA能神经元的表达。结果:1、动物实验:在野生型小鼠中,与空白组相比,6-OHDA组DA能神经元数量明显减少,DA及其代谢物的含量减少,小鼠行为能力下降,伴有小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,TNF-α和iNOS的蛋白水平增高,同时Nrf2信号通路的基因和蛋白水平增加;与6-OHDA组相比,ICA处理后,DA能神经元数量增加,DA及其代谢物的含量增加,胶质细胞的激活和炎性细胞因子的释放减少,进一步上调Nrf2信号通路的基因和蛋白水平。但是在Nrf2基因敲除型小鼠中,ICA的神经保护作用消失,ICA不能抑制胶质细胞的激活和炎性细胞因子的释放,并且ICA对Nrf2信号通路基因和蛋白的表达没有明显变化。2、细胞实验:在原代神经元培养和原代神经元-胶质细胞共培养中,6-OHDA组TH的表达减少,ICA处理后,只有神经元-胶质细胞共培养中TH的表达增加,而神经元培养(没有胶质细胞)中则没有神经保护作用。通过Nrf2-siRNA沉默胶质细胞中的Nrf2,应用Transwells构建重组的神经元-胶质细胞共培养,在该体系中,ICA对DA能神经元无保护作用。结论:ICA通过调节胶质细胞中的Nrf2抑制神经炎症并保护6-OHDA诱导的DA能神经元损伤。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

行为影响,小鼠,运动距离,空白

.1 ICA 对 6-OHDA 诱导的 DA 能神经元损伤的保护作用在野生型小鼠中，我们研究了 ICA对 6-OHDA诱导的DA 神经毒性的保护作用先，通过转棒实验和旷场实验检测小鼠的行为能力变化。如图 1A 和 B 所示，与组相比，6-OHDA 减少了小鼠的转棒时间和运动距离，ICA(60 mg/kg)处理后，时间和运动距离较 6-OHDA 组有所增加，单独给予 ICA(60mg/kg)后相对于空白鼠的运动能力无明显变化。免疫荧光结果显示，与空白组比较，单独给予 ICAg/kg)对中脑内 DA 能神经元无显著影响，而 6-OHDA 组的 DA 能神经元数量明少，ICA(60mg/kg)治疗后，DA 能神经元损伤得到改善(图 2A 和 B)。中脑 DA经元的蛋白定量与免疫荧光结果一致(图 2C)。如图 3A 和 B 所示，与空白组比较OHDA 降低小鼠纹状体内 DA 和 DOPAC 的含量，对 HVA 的含量没有显著影响 6-OHDA 组比较，ICA(60mg/kg)处理后 DA 的含量有所升高，而 HVA 和 DO含量无明显改变。此外，6-OHDA 组 DA 代谢物的比率增加，而 6-OHDA+ICA谢物比率降低。

免疫荧光染色,标尺,保护作用,空白

2 ICA 对 6-OHDA 诱导的 DA 能神经元损伤的保护作用 A. TH 免疫荧光染色；B. TH 阳性计数（标尺=200μm）；C.TH 蛋白的表达。（ x ±SEM，n=5） *P<0.05 与空白组比较；#P<0. 6-OHDA 组比较。ig.2ICAprotectedDAneuronsagainst6-OHDA-inducedneurotoxicityA.TH immunofluorescentaining; B.TH positive cell counting (Scale bar=200 μm); C. TH protein expression. ( ±SEM, n=P<0.05 vs control group,#P<0.05 vs 6-OHDAgroup.

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