水蛭的DNA分子鉴定和蛋白质分析

发布时间：2020-07-01 06:27

【摘要】：水蛭为蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体,具有破血通经,逐瘀消瘢之功效。在中药材市场上,水蛭的主要来源为蚂蟥(又称宽体金线蛭),另有少量的水蛭(又称日本医蛭),而柳叶蚂蟥(又称尖细金线蛭)较为罕见。随着近年来含水蛭中成药的不断开发,水蛭的需求量增加,已成为了紧俏中药材之一,市面上出现了以伪品菲牛蛭代替水蛭入药的情况。研究表明,伪品菲牛蛭和蚂蟥在发挥抗凝血活性时对凝血酶的作用机制以及抗凝血途径有一定区别,在临床上混用对患者用药安全与有效带来不良影响。传统的鉴定方法以水蛭的性状特征为依据,但在药材市场上,水蛭商品主要有清水吊干品、水蛭段和烫水蛭,在外形特征上与基原动物相比变化较大,很难准确鉴定;此外,蚂蟥作为中药水蛭的主要品种,其发挥抗凝血活性的物质基础和作用机制仍不明确。本论文研究依据正品水蛭及其常见伪品菲牛蛭的COI序列差异设计了物种特异性引物,并通过PCR建立水蛭的DNA分子鉴定技术,用于鉴定中药水蛭的真伪(掺伪);利用SDS-PAGE和2-DE分别对正品水蛭及其伪品基原动物的蛋白质进行分析,发现不同品种水蛭的电泳图谱中,存在稳定出现的蛋白质条带及斑点,可作为中药水蛭真伪鉴定的依据;选取不同品种水蛭的SDS-PAGE蛋白条带,对其胶内消化后所得的多肽片段混合物以MALDI-TOF-MS进行分析,鉴定所含有的蛋白质;此外,对蚂蟥中抗凝血活性蛋白质进行提取,以血浆复钙时间为活性指标,通过DEAE-52、Sephadex G-75和Sephadex LH-20对抗凝血蛋白质进行分离,并利用MALDI-TOF-MS进行鉴定。主要研究内容如下:(1)首先基于宽体金线蛭、尖细金线蛭、日本医蛭和菲牛蛭的COI序列基因差异设计筛选出3对特异性引物,提取不同品种水蛭的DNA,并对退火温度进行优化,确定最适的PCR扩增程序;然后对引物的特异性、灵敏度和适用性进行考察,最后将所建立的特异性引物扩增技术应用于市售水蛭商品的检测。结果表明,设计筛选得到的3对引物专属性强,其中宽体金线蛭和尖细金线蛭共用一对引物,目的产物长度为63 bp;日本医蛭和菲牛蛭的目的扩增产物长度分别为102 bp和75 bp。3对引物的特异性良好,彼此之间无交叉反应,且具有较高的灵敏度,同时还能用于鉴别掺伪品。此外,对水蛭市售商品的检测结果显示,19批次水

本文编号：2736398