保元汤调控AT1-CARP通路抑制心室重构防治心梗后心衰的作用机制研究

发布时间：2020-07-01 07:24

【摘要】：目的:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后导致的心力衰竭(heart failure,HF),因其发生伴随着严重的并发症和高死亡率,成为目前心血管领域研究的热点与难点。AMI后心室重构(ventricular remodeling,VR)被认为是引发HF的主要病理基础,因此,减轻AMI后的VR是治疗HF不容忽视的重要干预环节。现有治疗药物虽在临床上得到广泛应用,但其药效与安全性仍不甚满意。中医药在改善HF方面具有明显改善HF患者活动度、提高生存质量的特点,且用药安全性高,因而成为寻找HF新的治疗药物的重要领域。本研究以补气名方保元汤(Baoyuan decoction,BYD)为研究对象,拟以调控血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 11receptor,AT1)-心肌锚定重复蛋白(cardiac ankyrin repeat protein,CARP)通路为关键切入点,利用冠状动脉左前降支(left anterior descending,LAD)结扎术制备AMI后HF动物模型,结合Ang Ⅱ刺激制备心肌细胞凋亡及肥大模型,进一步构建pcDNA3.1-Ankrd1质粒并进行细胞转染制备过表达CARP细胞模型,从整体离体两个层面阐释保元汤抑制AMI后HF心肌细胞凋亡以及肥大等心室重构环节的药理机制。方法:1.采用LAD结扎术制备AMI后HF动物模型,分为假手术组,模型组,保元汤组,阳性对照药物福辛普利钠片组。于术后连续灌胃给药28d,对保元汤抗AMI后HF心肌细胞凋亡与肥大两大环节的主要药效指标进行研究:采用超声心动评价各组大鼠心功能;利用血生化检测测定各组大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量;采用酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血浆中心钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)和氨基末端脑钠肽前体(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP)的含量;利用放免法检测血浆中血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)的含量;利用Haematoxylin-eosin(HE)染色检测各组大鼠心肌组织中炎性细胞浸润及细胞肥大情况;TUNEL染色检测各组大鼠心肌组织中细胞凋亡情况:天狼星红染色检测胶原沉积情况;综合以上方法完成保元汤干预AMI后HF心室重构的药效评价。2.保元汤抑制AMI后HF心肌细胞凋亡的机制研究:体内实验部分,利用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测心肌组织中Ang ⅡⅡ的含量;利用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测心肌组织中肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)相关蛋白、CARP及其下游相关凋亡蛋白P53、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2Associated X Protein,Bax)等的表达;同时利用透射电镜观察线粒体结构。体外实验部分,采用Ang Ⅱ刺激制备H9C2细胞凋亡模型,结合CCK-8和Hoechst 33258法检测H9C2心肌细胞活力以及保元汤干预各组心肌细胞的凋亡情况;利用WB法检测心肌细胞中相关蛋白的表达;结合Rhodamine 123染色评价保元汤对Ang Ⅱ刺激导致的心肌细胞线粒体损伤的影响,综合以上结果阐释保元汤抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡的作用机制。3.保元汤抑制AMI后HF心肌细胞肥大的机制研究:体内实验部分,利用WB法检测心肌组织中AT1、Calpain 1、CARP以及其下游相关肥大蛋白钙调神经磷酸酶(Calcineurin)、GATA结合蛋白4(GATA binding protein4,GATA4)、细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signa regulated kinase 1/2,Erk1/2)的表达;体外实验部分,采用Ang Ⅱ刺激H9C2心肌细胞制备细胞肥大模型,利用罗丹明鬼笔环肽和DAPI染色法检测保元汤干预各组H9C2心肌细胞的肥大情况;利用WB法检测细胞中AT1、Calpain1、CARP以及p-GATA4、p-Erk1/2的表达;利用细胞免疫荧光法检测细胞质中CARP的表达;综合以上结果阐释保元汤抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的作用机制。4.为进一步验证CARP调控心肌细胞凋亡和肥大的途径以及保元汤能否通过干预CARP进而调控心肌细胞凋亡与肥大,在体外采用pcDNA3.1-Ankrd1质粒转染制备过表达CARP细胞模型,采用Hoechst 33258及罗丹明鬼笔环肽染色法检测心肌细胞凋亡与肥大情况;利用WB法检测心肌细胞中CARP以及相关凋亡和肥大蛋白的表达;综合以上结果阐释保元汤通过调控CARP进而调控心肌细胞凋亡与肥大的作用机制。结果:1.保元汤干预AMI后HF大鼠心室重构的药效学研究经保元汤治疗后,各组大鼠因损伤而下降的射血分数(ejection fraction,EF)和短轴缩短率(fractional shortening,FS)均得到不同程度地改善(P0.05,P0.01),提示保元汤能有效抑制缺血损伤引发的大鼠心功能的下降。此外,保元汤治疗还能显著抑制左心室舒张末期内径(left ventricular internal dimension diastole,LVIDd)以及左心室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)的增加(P0.01),提示保元汤能够在一定程度上抑制HF大鼠的心室重构。心肌酶谱检测结果显示,保元汤能够抑制心肌细胞中CK、LDH(P0.01)的释放。同时能有效抑制血浆中HF标志物以及Ang Ⅱ(P0.05)的水平,提示保元汤能抑制AMI导致的心肌损伤。HE染色结果显示,保元汤能够显著抑制心肌组织中的炎性细胞浸润以及心肌细胞肥大(P0.01)。TUNEL染色结果显示,保元汤能有效抑制梗死边缘区心肌细胞凋亡。天狼星红染色结果显示,保元汤能够抑制心肌间质胶原的过度沉积。以上结果提示,保元汤具有抑制AMI后HF大鼠心室重构进而改善心功能的作用。阳性对照药物福辛普利钠片也显示出较好的改善心功能、减少炎性细胞浸润及抑制细胞凋亡和肥大的作用。2.保元汤调控AT1-CARP通路抑制AMI后HF心肌细胞凋亡的机制研究IHC检测结果显示保元汤能够降低心肌组织中Ang Ⅱ的水平(P0.01);WB结果显示保元汤能够显著下调AT1(P0.01)、ACE1(P0.001)以及CARP(P0.01)的表达;同时抑制CARP下游促凋亡蛋白P53(P0.001)、Bax(P0.001)以及Cleaved caspase-3(P0.001)的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2(P0.05)与Mdm2(P0.01)的表达。透射电镜结果显示,保元汤能抑制线粒体结构损伤。体外细胞实验部分,MTT和Hoechst 33258检测结果表明保元汤能够抑制Ang Ⅱ诱导的H9C2心肌细胞凋亡。WB结果表明保元汤能通过下调心肌细胞中AT1、CARP以及P53和Bax的表达进而抑制细胞凋亡。此外,Rhodamine 123染色结果显示,保元汤能够抑制Ang Ⅱ刺激导致的线粒体膜电位损伤。3.保元汤调控AT1-CARP通路抑制AMI后HF心肌细胞肥大的机制研究WB结果显示:保元汤能够显著下调心肌组织中AT1(P0.01)、Calpain1(P0.01)以及CARP(P0.01)的表达,同时抑制CARP下游调控的促肥大蛋白GATA4(P0.001)和Erk1/2(P0.01)的磷酸化,对CARP下游另一肥大蛋白Calcineurin的表达没有明显的调控作用。体外细胞实验部分,罗丹明鬼笔环肽染色结果显示保元汤能够抑制Ang Ⅱ诱导的H9C2心肌细胞肥大。WB结果表明保元汤能显著下调心肌细胞中AT1、Calpain 1和CARP的表达,同时抑制CARP下游肥大蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化。此外,免疫荧光染色结果表明,保元汤能够抑制Ang Ⅱ诱导的细胞质中CARP的表达增加。4.保元汤调控CARP进而调控心肌细胞凋亡和肥大的机制验证Hoechst33258及罗丹明鬼笔环肽染色结果分别显示pcDNA3.1-Ankrd1质粒组H9C2心肌细胞发生明显的细胞凋亡并伴有细胞表面积的增加;保元汤能够显著抑制过表达CARP引发的心肌细胞凋亡,并且能够有效逆转心肌细胞的肥大。WB结果显示质粒转染组心肌细胞中CARP的表达明显上调,并且能够促进P53的表达、抑制Mdm2的表达;此外,心肌细胞中CARP相关肥大蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化水平也显著升高。保元汤不仅能够显著抑制CARP的过表达,同时也能够下调CARP下游凋亡蛋白P53的表达,并且对其调控的肥大相关蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化也有显著的抑制作用。结论:1.药效研究提示保元汤能有效改善AMI后HF大鼠心功能的急剧下降,同时能有效抑制心室重构引起的左心室内径增加,降低HF大鼠血清中CK和LDH的水平;有效降低循环中HF标志物及Ang Ⅱ的水平。此外,保元汤能够有效抑制心肌组织中炎性细胞浸润、心肌细胞肥大、细胞凋亡以及胶原的过度沉积。以上药效结果共同提示保元汤改善AMI后HF大鼠心功能的作用与其抑制心肌细胞凋亡和肥大等心室重构病理环节密切相关,为后续的机制研究提供方向。2.保元汤抗心肌细胞凋亡作用的体内与体外机制研究结果表明:心肌缺血导致心肌组织中Ang Ⅱ水平升高,进一步激活其受体AT1的表达,使得心肌组织中CARP蛋白出现高表达状态;进而启动P53-线粒体凋亡途径,使得心肌细胞中P53、Bax以及Cleaved caspase-3的表达升高,Bcl-2、Mdm2的表达下降。给予保元汤干预后,能够有效抑制心肌组织中Ang Ⅱ的水平,进一步下调AT1的表达,进而抑制心肌细胞中CARP的高表达;同时保元汤能够促进抗凋亡蛋白Bcl-2、Mdm2的表达,并抑制促凋亡蛋白P53、Bax以及Cleaved caspase-3的表达,进而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。同时,利用pcDNA3.1-Ankrd1质粒转染使得CARP在H9C2心肌细胞中过表达,给予保元汤进行干预,结果显示保元汤能够有效抑制心肌细胞中过表达的CARP的水平,且对其下游调控分子P53亦有相同的抑制作用。综上,保元汤能通过调控AT1-CARP通路进而抑制AMI后HF大鼠心肌细胞凋亡;CARP成为保元汤改善心功能、抑制心肌细胞凋亡的关键蛋白以及潜在靶标。3.保元汤抗心肌细胞肥大作用的体内与体外机制研究结果表明:AMI术后28 d,伴随着心肌组织持续的心肌缺血,心肌细胞中AT1-CARP通路激活的同时,CARP下游调控肥大的GATA4/Erk1/2通路被激活,进而诱导心肌细胞面积增大、加重HF程度。给予保元汤干预后,能够通过调控AT1-CARP通路,进而抑制GATA4/Erk1/2肥大途径中相关蛋白的磷酸化,保持心肌细胞的正常大小与直径,预防心室重构的发生并延缓HF恶化的程度。同时,通过在体外对CARP的过表达以及保元汤的干预,结果发现,保元汤在通过AT1调控CARP的表达量的同时,能够抑制CARP的过表达,进而抑制促肥大蛋白GATA4的磷酸化,多途径发挥抗心肌细胞肥大的作用。同时,该结果亦提示CARP为保元汤发挥抗心肌细胞肥大作用的关键蛋白与潜在靶标。4.本研究通过对补气名方保元汤抑制AMI后HF心肌细胞凋亡及肥大药效以及通过调控AT1-CARP通路抗凋亡和肥大作用机制的阐明,尤其是对CARP调控心肌细胞凋亡、肥大机制的验证以及保元汤对CARP调控作用的阐明,为以CARP为新的关键蛋白与靶标抑制心室重构延缓HF进程的治疗提供新的干预途径与治疗思路,并为保元汤防治HF的临床应用以及新药开发乃至组方的二次优化提供有力的实验依据。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

示意图,蛋白结构,示意图,卷曲螺旋

ＣＡＲＰ基因定位在人类基因组中的１０号染色体上，且ＣＡＲＰ蛋白序列在哺乳动物中高逡逑度保守［９］。ＣＡＲＰ的ｃＤＮＡ长度为１９０１个碱基对，编码由３１９个氨基酸组成的蛋白质产物，逡逑理论分子量为３６，２５２邋Ｄａ［２］。ＣＡＲＰ蛋白结构由如下特征组成（图１）：邋（１）卷曲螺旋结构逡逑域（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｄｏｍａｉｎ）；邋（２）串联锚定重复序列（ＡＮＫ）；邋（３）核定位特征基序；（４）逡逑ＰＥＳＴ蛋白降解序列；（５）推定的翻译后修饰位点［１（）］。卷曲螺旋基序通常由２－５个ａ－螺旋逡逑的超螺旋组成，它们彼此缠绕并且在结构上能够介导蛋白质的低聚化［１１］。此外，Ｗｉｔｔ逡逑等研究表明，尽管蛋白之间相互作用相对较弱，ＣＡＲＰ的卷曲螺旋结构域仍有助于其自逡逑身二聚化［１２］。逡逑１３逡逑

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Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＢＹＤ邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ逦Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＢＹＤ邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ逡逑图２．２各组大鼠超声指标分析逡逑注：与模型组比较，＞＜０．０５，＊＞＜０．０１；与假手术组比较，＿Ｐ＜０．００１逡逑２．保元汤对心梗后心衰大鼠心肌酶的影响逡逑为了更好的评判心梗后心肌损伤程度，本研究对血清中相关损伤标志物进行检测。逡逑３８逡逑

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