基于泛素化蛋白质组学及肠道菌群的滋补脾阴方药对情志应激所致糖尿病认知功能障碍的研究

发布时间：2020-07-03 15:27

【摘要】：研究表明在概念、临床范畴、发病条件等方面,情志与心理应激有着很多的相似性,情志致病学说与心理应激反应有着本然的一致性。随着2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)发病率在全国乃至全球范围内的逐年升高,心理应激与糖尿病发病的相关性越来越引起人们的关注。心理应激能提高糖耐量减低者发展成糖尿病的机率。糖尿病可引起大脑认知功能紊乱,表现出轻、中度的认知障碍以及学习记忆能力的下降,这种疾病即为糖尿病认知功能障碍(Diabetes-Associated Cognitive Decline,DACD),严重者可发展为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)。目前尚未发现DACD的特征性神经病理改变,多项研究表明其发病机制和病理学改变与AD相似。研究发现AD患者和动物脑内均发生蛋白质泛素化,依赖于E3连接酶,慢性心理应激通过增加泛素化及降解,能够引起认知功能损伤。提示情志所致的DACD可能与脑内蛋白质泛素化有关。此外,研究还发现慢性心理应激可使肠道内致病菌增加,有益菌减少等。肠道菌群的失调可导致T2DM及其并发症认知功能障碍的发生发展。蛋白质组学能够在整体水平上对基因组表达的全部蛋白质进行大规模研究,进行蛋白质组学的研究可加快对疾病病理改变的认识。现在对于DACD的蛋白质组学研究还很浅,对其泛素化蛋白质组学方面的分析更少,而多个针对AD的研究已经证实了蛋白质泛素化在AD等神经退行性疾病中具有重要作用。因此,DACD脑内泛素化蛋白质组学研究将有助于理解其发病机理。平衡的肠道菌群不仅在宿主的新陈代谢中发挥关键作用,而且还可以形成一个天然屏障,抵御外来病原菌的侵袭。一旦肠道菌群的平衡被打破,则宿主表现为疾病易感性。人体许多疾病如T2DM的发生发展都与肠道菌群的失调有关系,肠道菌群在T2DM的发生与转归中扮演着重要角色。近年来大量研究还发现肠道菌群的改变与认知行为之间存在明显的相关性。肠道菌群的改变会影响宿主的行为,比如认知功能损伤、抑郁和焦虑等。目前仍然没有公认的治疗DACD的有效措施。中医学认为DACD属于“消渴”合并“健忘”或“呆症”。在多年临床经验的基础上,战丽彬教授依据清代·吴澄《不居集》中记载的资成汤加味而成滋补脾阴方药(ZiBu PiYin Recipe,ZBPYR)。该方不仅能改善临床患者健忘、呆症等认知障碍的症状,而且还能改善脾阴虚痴呆大鼠、老龄大鼠、自发性糖尿病肥胖大鼠(Zucker Diabetic Fatty Rats,ZDF)大鼠、高脂喂养联合链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)注射诱发的糖尿病大鼠以及db/db小鼠的认知功能。综上,本研究一是观察ZDF大鼠学习记忆能力的行为学表现及情志应激是否促进了DACD的发生发展;二是基于非标记定量Label-free联合液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的泛素化蛋白质组学技术以及生物信息学分析找寻脑内和情志应激所致DACD发病、ZBPYR干预作用紧密相关的泛素化蛋白质和生物学通路,以期为研究情志应激所致DACD的发病机制以及ZBPYR的治疗机制提供新线索;此外,基于16S rRNA技术,我们动态观察了情志应激所致DACD及ZBPYR干预后发生发展过程中肠道菌群的变化,阐明ZBPYR对肠道菌群的动态调节作用。一、理论研究本章较为系统地对情志与DACD的相关性进行了探讨分析,对中医学、现代医学对DACD的认识及治疗的现有研究进展进行总结,同时对“从脾论治”ZBPYR治疗DACD的理论、情志应激所致DACD动物模型的建立进行多方面、多层次、多方向的探讨,为“脾主思藏意”,“思伤脾、脾失藏意”引起DACD的理论内涵和基础研究提供支撑和依据。本章研究为论文的设计和系统研究提供基础。二、实验研究目的:1.观察ZBPYR对情志应激所致DACD大鼠学习记忆能力的影响;2.对情志应激所致DACD大鼠全脑组织进行泛素化蛋白质组学研究以寻找出差异表达的泛素化蛋白质;3.差异表达的泛素化蛋白质用于生物信息学分析,以期了解与DACD发病密切相关的生物学通路和蛋白质相互作用网络,并分析ZBPYR的可能作用靶点;4.阐明泛素化蛋白质组学结果的可靠性,并初步分析差异表达的泛素化蛋白质丰度改变与mRNA水平变化的关系;5.动态观察情志应激所致DACD大鼠肠道菌群的变化及ZBPYR的调节作用。方法:瘦型同窝大鼠(Lean Zucker rat,LZ)为对照组,自发性2型糖尿病模型ZDF大鼠随机分为糖尿病模型组(ZDF)、糖尿病模型+情志组(ZDF_P)、糖尿病模型+情志+滋补脾阴方药治疗组(P_Z),共4组。1.通过监测随机血糖(Random blood glucose,RBG)、空腹血清胰岛素(Fasting serum insulin,FSI)、口服葡萄糖耐量实验(Oral glucose tolerance,OGTT)和胰岛素耐量实验(Insulin tolerance,ITT),观察4组大鼠的糖尿病状态和ZBPYR的干预作用。通过检测皮质酮,观察各组大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)是否被激活。2.通过行为学实验,包括旷场、避暗以及水迷宫实验,观察4组大鼠的学习记忆能力和ZBPYR的干预作用。3.利用Label-free联合LC-MS/MS技术进行泛素化蛋白质组学分析,筛选差异表达的泛素化蛋白质。4.通过GO分类注释、KEGG通路和蛋白质相互作用网络,对差异表达的泛素化蛋白质进行生物信息学分析。5.在蛋白水平上,利用Western blotting技术验证泛素化蛋白质组学的结果可靠性;利用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR,qPCR)初步分析差异表达的泛素化蛋白质丰度改变和mRNA水平变化的关系。6.基于16S rRNA技术进行肠道菌群分析,分析肠道菌群物种的丰度和多样性,寻找ZBPYR作用的肠道菌群靶点。结果:1.ZDF组大鼠每周的RBG均明显升高,葡萄糖机能受损,存在糖耐量异常和外周胰岛素抵抗;情志应激加重了大鼠的葡萄糖机能受损和外周胰岛素抵抗;给予ZBPYR治疗后,大鼠葡萄糖耐量得到改善,外周胰岛素抵抗减轻。情志应激显著升高了大鼠的皮质酮水平,ZBPYR治疗能够显著降低其水平。2.在旷场实验中,ZBPYR治疗显著升高了大鼠的正中格停留时间、中央格穿梭以及直立次数,有增加大鼠运动总距离的趋势。在避暗实验中,ZBPYR治疗有延长大鼠潜伏期的趋势。在Morris水迷宫定位航行实验中,接受ZBPYR治疗后的P_Z组大鼠训练第5天的潜伏期明显缩短。在Morris水迷宫空间探索实验中,ZBPYR治疗有增加大鼠寻找原平台所在位置的时间、在原平台所在象限停留时间及穿越原平台位置的次数的趋势。在Morris水迷宫可视化平台实验中,4组大鼠的游泳距离和寻找可见平台的潜伏期比较无统计学差异。3.共鉴定到1,680个泛素化位点,1,620个泛素化肽段,842个泛素化蛋白质。与LZ组比较,在ZDF组发现56个上调及144个下调的差异表达泛素化蛋白质;与ZDF组比较,在ZDF_P组发现69个上调及58个下调的差异表达泛素化蛋白质;与ZDF_P组比较,在P_Z组发现52个上调及124个下调的差异表达泛素化蛋白质。此外,在上述两两比较中,发现16个共同差异表达的蛋白质。4.生物信息学方法:差异表达泛素化蛋白质主要位于细胞、细胞器以及细胞膜;细胞过程、单生物过程、生物调节、多细胞生物过程和代谢过程是其参与的主要生物学过程。LZ组和ZDF组的差异表达蛋白质主要参与的KEGG通路有10条,包括胰岛素分泌、胰腺分泌、cAMP信号通路等;ZDF组和ZDF_P组的差异表达蛋白质主要参与的KEGG通路有11条,包括cAMP信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号、胰岛素分泌等;ZDF_P组和P_Z组的差异表达蛋白质主要参与的KEGG通路有21条,包括内吞作用、多巴胺能突触、cAMP信号通路等。通过使用IntACT数据库发现LZ组与ZDF组、ZDF组与ZDF_P组、ZDF_P组与P_Z组分别存在79、51、59个相互作用的差异表达蛋白质。5.通过使用Western blotting技术验证选取的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ型亚基 α(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit alpha,Camk2α)、钠/钾转运 ATP 酶亚基 β-1(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1,Atp1b1)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(o)亚基α(Guanine nucleotide-binding protein G(o)subunit alpha,Gnao1)、磷酸丙糖异构酶 1(Triosephosphate isomerase,Tpi1)4个差异表达泛素化蛋白质,其结果与泛素化蛋白质组学的结果一致。qPCR结果表明,ZDF组Camk2α mRNA表达较LZ组明显降低,P_Z组Camk2α mRNA表达较ZDF_P组显著上调。Atp1b1 mRNA、Gnao1 mRNA、Tpi1 mRNA的表达变化与蛋白质水平变化趋势相一致,但未达到统计学差异。6.肠道菌群分析:微生物群落α多样性指数结果显示,给予ZBPYR可动态降低Chao1、ACE指数。在门水平上,所有样品以厚壁菌门和拟杆菌门为主,且丰度随时间的变化发生了动态变化。在属水平上,各组样品中优势菌属为乳酸杆菌属;萨特氏菌属、罗氏菌属、双歧杆菌属、链球菌属、普雷沃菌属、乳酸杆菌属等随时间的变化菌属丰度发生了动态变化。样品主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、主坐标分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA)和UniFrac距离组间/组内差异比较分析能够看出ZDF组、ZDF_P组样品与LZ组样品很好地分离,而P_Z组样品分布于ZDF组与ZDF_P组之间,表明ZBPYR可调节DACD大鼠肠道菌群结构。结论:1.自发性糖尿病肥胖ZDF大鼠符合DACD的行为学改变,是良好的DACD动物模型。情志应激促进和加重了DACD的发生发展。ZBPYR除了能改善DACD大鼠的RBG升高等糖尿病特征外,还可提高学习记忆能力。情志应激激活了ZDF大鼠的HPA轴,ZBPYR能够抑制HPA轴的激活。2.应用Label-free联合LC-MS/MS的蛋白质非标记定量技术,构建了LZ大鼠和ZDF大鼠的泛素化蛋白质图谱,奠定了深入研究蛋白质泛素化与DACD相关性的基础;发现200个差异表达泛素化蛋白质与DACD发病相关,127个差异表达泛素化蛋白质与情志应激相关,以及可能是ZBPYR作用的16个差异表达泛素化蛋白质靶点。3.生物信息学分析阐明了大鼠全脑组织中差异表达泛素化蛋白质的GO分类、KEGG通路和蛋白质网络相互作用,为DACD发病机制的基础研究和ZBPYR的治疗机制研究奠定了基础。4.通过使用Western blotting技术证实了本次实验中泛素化蛋白质组学技术的可靠性。qPCR结果提示蛋白质表达水平的改变可能不完全源于mRNA的变化。5.肠道菌群分析结果表明ZBPYR能显著性改善失调的肠道菌群多样性并动态降低Chao1、ACE多样性指数。人和大鼠微生物在门的组成上是相同的。从动态发展过程看,ZBPYR可升高乳酸杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌属、Anaerostipes属丰度;可降低Allobaculum、另枝菌属、变形杆菌属、粪球菌属丰度。ZBPYR能显著调节情志应激所致DACD引起的益生菌和致病菌紊乱。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

大鼠,统计学意义,组间,和图

＿Ｚ逡逑组大鼠有降低的趋势（表丨－２和图１－２Ａ）。ＦＳ丨水平在４组间没有统计学意义（表逡逑１－３邋和图邋１－２Ｂ）。逡逑表邋１－２邋大鼠邋ＲＢＧ邋（邋ｘ土ｓ，ｍｍｏｌ／Ｌ）逡逑分组第１周第２周第３周第４周邋第５周邋第６周邋第７周邋第８周逡逑３８逡逑

电泳图,电泳图,大鼠,样品

图２．１－１各组大鼠样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图逡逑Ｆ大鼠全脑泛素化蛋白质组学的鉴定结果逡逑质谱定量分析及ｍａｘｑｕａｎｔ查库来获得样本的肽段丰度信息。以ｐｒｏｔｅ０．０１，ｐｅｐｔｉｄｅ邋ＦＤＲ彡０．０１为筛选条件对结果进行过滤。最终鉴定至ｌｊｌ，６化位点，１，６２０个泛素化肽段，８４２个泛素化蛋白。逡逑ｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ邋分析逡逑ｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（简称ＧＯ）可用来全面描述生物体中基因和基因产物的属数据库中有３个独立的本体（Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）：生物学过程（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ分（ＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ）、分子功能（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＦｕｎｃｔｉｏｎ）。逡逑本研究中，通过Ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ软件，懫用ＧＯ分类注释（ｌｅｖｅｌ邋的泛素化蛋白质。对于３个本体（生物学过程、细胞组分、分子功能）的条目，将所有相应泛素化的蛋白质个数列出，并做出饼状统计图２．１－２．１－４。ＧＯ分类图显示了邋３个本体中所涉及到各条目的分布情况，并以标记各个条目。逡逑

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