阴地蕨化学成分提取分离及其生物活性分析

发布时间：2020-07-05 13:33

【摘要】：阴地蕨(Botrychium ternatum(Thunb)Sw.)属于阴地蕨科阴地蕨属植物,是一种用途广泛的民间中草药,在传统中医中,阴地蕨归肝经、肺经,性味甘平、味淡,具有清热解毒、平肝息风、止咳、止血、明目去翳的作用,主治小儿高热惊搐、肺热咳嗽、百日咳、癫狂、痢疾、疔疮痈毒、毒蛇咬伤、目赤火热、目生翳障等。阴地蕨全株含有阴地蕨素、木犀草素等成分,其中大部分有效成分尚未完全明确。本论文对阴地蕨展开化学成分提取分离及生物活性的研究,主要研究结果如下:1、阴地蕨不同部位乙醇提取物黄酮与酚酸含量分析和抗氧化活性研究:采用75%乙醇加热提取,测定提取率;以芦丁、没食子酸为标准品,用分光光度法测定了阴地蕨不同部位的黄酮和酚酸含量;利用分光光度法测定阴地蕨不同部位对DPPH、ABTS自由基的清除能力以及对Fe的还原能力。结果显示,阴地蕨全株各部位的乙醇提取率均超过20%,其中地上部分提取率达44.6%;不同部位阴地蕨总黄酮和酚酸含量有一定差异,两类物质地上部分均高于地下部分,地上部分的总黄酮含量高于酚酸含量,而地下部分总黄酮含量则低于酚酸含量。阴地蕨乙醇提取物的抗氧化能力随总黄酮及酚酸含量的升高而增强,但是地上部分对于DPPH自由基清除率高于地下部分,而对于ABTS自由基的清除率则低于地下部分,对于Fe的还原能力,两部分表现差异不大。2、阴地蕨多糖含量分析及生物活性研究:采用煎煮、浓缩、醇提的方法提取阴地蕨全草粗多糖,计算提取率;以葡萄糖、牛血清白蛋白为标准品,用分光光度法测定了阴地蕨粗多糖中多糖和蛋白质含量;利用分光光度法测定阴地蕨粗多糖的抗氧化能力;利用圆纸片扩散法测定阴地蕨粗多糖的抑菌能力;利用MTT法测定阴地蕨粗多糖的抗肿瘤能力。结果显示,阴地蕨全株均含有多糖物质和蛋白质,其中多糖含量达20.60%,是蛋白质含量的5倍。阴地蕨粗多糖的抗氧化能力随多糖含量的升高而增强,但增强幅度有限,其对于ABTS自由基清除能力高于对DPPH自由基清除能力。阴地蕨粗多糖对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中抑制大肠杆菌的能力更强。阴地蕨粗多糖对于人宫颈癌(Hela)细胞和人肺癌(A-549)细胞的增殖均具有抑制作用,其中对于肺癌细胞增殖的抑制作用更强;在相同的培养时间下,其抑制效果随给药浓度的增加而增强;在相同给药浓度的条件下,随着培养时间的延长,其抑制效果出现了先增强后减弱的趋势。3、阴地蕨不同有机相的提取及生物活性研究:采用95%乙醇浸泡、低压旋蒸浓缩的方法对阴地蕨全草粉末进行萃取,继而分别使用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷三种有机溶剂进行二次萃取,得不同有机相提取物。对不同提取物进行生物活性研究,抗氧化活性研究表明:乙酸乙酯(EtOAc)部分提取物对DPPH、ABTS自由基清除能力均大于石油醚(PE)部分;抗菌活性研究表明:EtOAc部分和PE部分提取物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抑制作用,两者对大肠杆菌的抑制效果均优于金黄色葡萄球菌,对大肠杆菌的抑菌活性方面,PE部分优于EtOAc部分,而对金黄色葡萄球菌的抑菌活性方面,低浓度条件下PE部分优于EtOAc部分,高浓度下则相反;抗肿瘤细胞活性研究表明:PE和EtOAc部分提取物均对人宫颈癌(Hela)细胞和人肺癌(A-549)细胞具有抑制作用,且高浓度(320μg/mL)下抑制效果明显,同一浓度下的抗肿瘤活性随着培养时间的延长,表现出先增强后减弱的趋势。4、阴地蕨提取物化学成分分离与结构鉴定:运用硅胶柱分段、MCI树脂去除色素、MPFC分离、TLC分离及初步检测、重结晶提纯等方法对阴地蕨石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷部分提取物进行分离,得到11种化合物,用核磁氢谱、碳谱、二维谱、质谱等方法鉴定了10个化合物,确定了其中9个化合物的结构,除木犀草素、胡萝卜苷和β-谷甾醇外,其余7个均为阴地蕨首次分离,分别是:新松香酸、2',3'-二羟基十五烷酸丙酯、山嵛酸环氧乙烷甲酯、对羟基苯甲酸、苯十三酸甲酯、hopane-22,29-diolmonoacetate以及结构待定的YDJ1。阴地蕨提取物中分离得到的这些化合物,分别属于黄酮类、酚酸类、长链脂肪酸酯类、芳香酯类、甾体类和萜类。本文对明确阴地蕨有效成分,阐明其药用价值以及对其进一步开发利用有一定的指导意义。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284
【图文】：

标准曲线,试管,没食子酸,酚酸

图 2-1 芦丁标准曲线Fig.2-1 The standard curve of Rutin.3 不同部位阴地蕨乙醇提取物酚酸含量的测定1、没食子酸标准曲线的制作取 12 支 4mL 试管编号 a~f 和 0~5，试管 a~f 中分别加入没食子酸标品 1.0，1.4，1.8mL，然后再分别以甲醇溶液补足 2mL 混匀，每管取 60对应新的试管 0~5 中，加入 1.54 mL 超纯水，再加入 Folin-CiocalteL（福林试剂与水的体积比为1:2），避光振荡3min后，加300μL20%的N，随后在 30℃下避光水浴 1h，以 0 号试管为空白对照，测定在 750nm OD 值[99]。对 OD 值与没食子酸标准品质量分数作回归处理，得回归6.042x - 0.0069，R2=0.9896，线性良好，见图 2-2。2、酚酸含量的测定将提取的干样品加入甲醇溶液配制成质量分数为 1 mg/mL 的待测样品

标准曲线,没食子酸,标准曲线

图 2-2 没食子酸标准曲线Fig.2-2 The standard curve of Gallic Acid2 不同部位阴地蕨乙醇提取物抗氧化活性的测定.1 不同部位阴地蕨对 DPPH 自由基清除能力的测定1、DPPH 溶液的制备：精密称取 19.7mgDPPH 粉末溶于 250 mL 无水搅拌溶解，室温下避光贮存。2、抗坏血酸（Vc）标准曲线的制作（以 Vc 作为阳性对照）：取 6 支 2mL 编号为 0~5 的试管，分别加入 0、10、20、30、40、50 μL 0.1mC，再分别用纯水补足 500μL，然后各加入 500 μL 的 DPPH 溶液，摇静置 30 min。以 0 号试管为空白对照，测定 517nm 波长下的 OD 值。3、样品测定

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