模拟糖尿病并发抑郁症状态下胎鼠海马神经元突触可塑性损伤机制及中药干预研究

发布时间：2020-07-05 15:54

【摘要】：目的:以模拟糖尿病并发抑郁症(DD)状态下胎鼠海马神经元为研究对象,探讨海马神经元突触可塑性障碍导致DD发生的分子机制,并给予中药复方左归降糖解郁方干预,为DD发病机制的研究及防治提供新的思路与靶点。方法:1、取7-10d的胎鼠海马进行分离、纯化、培养,神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。2、将培养的海马原代神经元随机分为六组:空白组、对照组、模型组、NR阻断剂组(MK-801)、阳性药组(二甲双胍+氟西汀)、左归降糖解郁方组。根据分组情况,模型组加入高糖(15 mmol/L)和皮质酮(50μmol/L),对照组、阳性药组、左归降糖解郁方组于造模后分别加入体积分数10%的空白血清、阳性药含药血清、左归降糖解郁方含药血清,空白组加入10%的培养液,阻断剂组加入MK-801(10μmol/L),干预18h。采用高内涵细胞成像分析技术(High Content Analysis,HCA)检测CRHR1、GR、NR2A、NR2B、CaMK II、SynGap蛋白的表达;采用全细胞膜片钳记录海马神经元细胞mEPSC,比较各组神经元细胞mEPSC频率和电流幅度的差异。结果:1、经倒置显微镜观察、NSE免疫细胞化学鉴定,所培养细胞为海马神经元细胞,且纯度达95%以上。2、经HCA分析显示,空白组神经元形态完整,胞体饱满,突触之间相互交织成神经网络。与空白组比较,模型组和对照组海马神经元萎缩,突触断裂或神经网络消失,CRHR1、NR2A、NR2B和CaMKII蛋白荧光强度上升,GR和SynGAP蛋白荧光强度降低(P0.01)。与对照组比较,NR阻断剂组、阳性药组和左归降糖解郁方组突触连接恢复,NR2A、NR2B和CaMKII蛋白荧光强度降低,SynGAP蛋白荧光强度上升(P0.01或P0.05);阳性药组和左归降糖解郁方组CRHR1蛋白荧光强度降低,GR蛋白荧光强度上升(P0.01),而NR阻断剂组则无明显差异。膜片钳检测,与空白组比较,模型组和对照组海马神经元细胞mEPSC的频率和电流幅度都显著上升(P0.01);与对照组比较,NR阻断剂组、阳性药组和左归降糖解郁方海马神经元细胞mEPSC的频率和电流幅度显著下降(P0.01)。结论:左归降糖解郁方对模拟DD状态下海马神经元GR、CRHR1、NR2A、NR2B蛋白的调控作用,以及对DD海马神经元突触可塑性结构与功能的调控作用,可能是抗DD大鼠神经元损伤的保护机制。
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

原代神经元,海马

8经网络。经 HCA 检测，NSE 染色后阳性者呈绿色荧光，阳性率达 95%以上，该阳性细胞即海马神经元。结果见图1。图 1 海马原代神经元的一般形态学观察及鉴定A：培养 7d 的细胞；B：NSE 免疫细胞化学染色；标尺：100μm3.2 对 GR、CRHR1 蛋白表达的影响经高内涵成像系统分析后显示，蓝色荧光为 DAPI标记的细胞核，橙黄色荧光为 R-PE标记的细胞骨架，绿色荧光为FITC 标记的GR 或CRHR1，而荧光强度与蛋白表达水平呈正相关。空白组神经元神经元形态完整，各突触之间相互接触形成致密的神经网络，组织碎片少。与空白组比较，对照组与模型组的突触之间连接断裂，碎片增多，GR 荧光强度值明显下降，CRHR1 荧光强度值明显上升

海马神经元,含药血清,荧光强度,阻断剂

含药血清组和左归降糖解郁方含药血清组、NR阻断剂组突起与突起之间形成网络结构，阳性药含药血清组和左归降糖解郁方含药血清组能逆转 GR 和 CRHR1 的表达，差异具有显著性统计学意义（P<0.01），阻断剂组无明显变化。结果见图2-4。图 2 各组海马神经元 GR 和 CRHR1 的荧光强度值情况A 空白组；B 模型组；C 对照组；D NR 阻断剂组；E 阳性药含药血清组；F 左归降糖解郁方含药血清组；与 A 比较，**P<0.01；与 B 比较，##P<0.01

【参考文献】