葛根提取物对镉致糖尿病肾病小鼠保护作用的研究

发布时间：2020-07-05 19:53

【摘要】：糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管病变引起的肾小球硬化症,随着我国糖尿病患者人数的增加,DN的发病率也呈逐年增长的趋势,其发病机制复杂,与基因、生活习惯及环境因素相关,前期研究发现镉暴露会加速DN的发生,但其具体作用机制尚未阐明。葛根在治疗糖尿病方面历史悠久,且其诸多有效成分在现代药理学研究中也展现出较好的生物活性,但葛根对镉致糖尿病肾病的保护无相关报道。因此,本课题通过构建DN模型,对比镉(Cd)、高脂高糖饲料(HF)和镉联合高脂高糖饲料(HF+Cd)处理时小鼠的损伤效果,明确镉和高脂高糖饮食在DN发生中的作用。给予DN小鼠不同剂量的葛根提取物,研究葛根提取物对DN保护的量效关系,确定最佳给药量,结合组织形态学观察验证葛根提取物的保护效果。基于代谢组学技术比较空白组、DN模型组和葛根提取物保护组的代谢物轮廓,筛选差异显著的潜在生物标记物,结合生物信息学分析,探讨葛根提取物保护的可能机制。结合Western blot技术和RT-PCR技术,对DN的发病机制和葛根提取物可能保护途径进行验证。本课题旨在明确葛根提取物对镉致糖尿病肾病的保护作用及其可能机制,为DN的临床诊断和防治提供数据参考。具体研究如下:1.糖尿病肾病小鼠模型的构建以及葛根提取物保护效果研究(1)镉致糖尿病肾病损伤模型的验证a.对生理指标数据分析发现,与Con组相比,HF+Cd组空腹血糖值升高60%(p0.05),饮食量、饮水量都发生大幅度升高,体重持续下降,符合糖尿病的“三多一少”临床特征。b.对糖脂代谢水平研究发现,与Con组相比,HF+Cd组的TC含量升高(p0.05),TG含量降低(p0.05),HDL极显著降低70%(p0.001),LDL含量极显著升高(p0.001)。c.对肾功能评价发现,与Con组相比,HF+Cd组的肾脏系数、NAG、CER和BUN均发生极显著升高(p0.001,p0.001,p0.001,p0.001)。说明氯化镉和高脂高糖饲料对小鼠均损伤作用,但二者联合诱导时,HF+Cd组损伤效果加倍。(2)葛根提取物(GG)对DN小鼠保护效果研究a.对生理指标分析发现,与DN组相比,保护组小鼠的饮水量、饮食量减少,体重回升,且空腹血糖接近K组,其中GG_M组的效果最明显。b.对糖脂代谢水平研究发现,与DN组相比,GG_M组的TC含量显著降低(p0.01),HDL水平显著升高(p0.01)。c.对肾功能评价发现,与DN组相比,GG_M组的NAG活力显著降低(p0.01),CRE和BUN含量极显著降低(p0.001,p0.001)。说明葛根提取物对DN的保护作用与给药剂量呈U型关系,且中剂量给药组的保护效果最佳。(3)组织形态学分析通过HE、PAS和Masson染色法观察小鼠肾脏病理改变,发现DN小鼠肾小球系膜增生,间质炎症细胞浸润,并伴有间质水肿现象。GG_M组小鼠肾小球结构基本完整,上述病变减弱,组织结构趋近正常小鼠。肾脏透射电镜结果显示,DN小鼠基底膜增厚,足突肿胀肥大,畸形线粒体增多,GG_M组小鼠细胞结构整齐,上述病变减弱。胰脏透射电镜结果显示,DN小鼠β细胞呈不规则肥大,出现两两融合,线粒体畸形改变,GG_M组小鼠细胞上述病变减弱。表明葛根提取物可以缓解DN小鼠肾脏和胰脏病变,对DN小鼠起到保护作用。2.基于代谢组学分析葛根提取物对糖尿病肾病的保护作用采用UPLC-Q-TOF和GC-MS技术对各组小鼠血清样品分析发现,空白组、DN模型组和保护组的组内聚集度良好、组间分离度较大。筛选出脂质类如:LysoPI(20:0/0:0),胆汁酸类如:Taurohyocholate等多种不同类别的差异性生物标记物。并分析得出甘油磷脂代谢、线粒体中脂肪酸延长等代谢通路发生变化。提示线粒体功能障碍导致能量代谢异常,可能是DN发病的关键因素。3.基于AMPK/SIRT1/PGC1α和PINK/PARKIN通路研究葛根提取物对DN小鼠的保护作用a.AMPK/SIRT1/PGC1α通路与空白组相比,DN小鼠的AMPK蛋白表达量极显著上调(p0.001);SIRT1蛋白表达量下调(p0.01);PGC-1α蛋白表达量极显著下调(p0.001)。与DN模型组相比,保护组AMPK蛋白表达量极显著下调(p0.001);SIRT1和PGC-1α蛋白表达量极显著上调(p0.001,p0.001)。说明DN小鼠的AMPK/SIRT1/PGC1α通路受到抑制,葛根提取物可以激活AMPK,促进SIRT1表达,提升PGC-1α去乙酰反应,促进线粒体生物发生。b.PINK1/PARKIN通路与空白组相比,DN组PINK1蛋白水平显著下调(p0.01);PARKIN蛋白表达量上调(p0.05)。与DN组相比,保护组的PINK1蛋白表达量显著上调(p0.01);PARKIN蛋白表达量显著下调(p0.01)。说明DN小鼠的PINK1/PARKIN通路受到抑制,葛根提取物可以刺激PINK1蛋白的表达,激活PARKIN蛋白对受损线粒体的泛素化过程,促进线粒体自噬的进行。提示DN的发生与线粒体生物发生、线粒体自噬这一动态平衡被打破有关,葛根提取物对DN小鼠的保护作用也可以通过恢复这一动态平衡来实现。
【学位授予单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

小鼠,生化指标,毛色,活动量

陕西科技大学硕士学位论文2.4 实验结果通过对不同组别小鼠体重、饮食等生理变化分析可以初步得出小鼠的精神状态，推测出小鼠的健康状况。对血液中脂类代谢物分析，可以评价小鼠的代谢机制是否处于正常状态。对血液中肾功能评价指标分析，可以了解小鼠肾脏组织的健康状况以及疾病的发生程度。所以，将实验结果从下面几个方面展示：2.4.1 镉致糖尿病肾病损伤模型的验证对 Con 组、HF 组、Cd 组和 HF+Cd 组小鼠的各项试验结果分析如下：a. 不同损伤形式对小鼠生理、生化指标的影响

脂质含量,小鼠血清,高糖饮食

葛根提取物对镉致糖尿病肾病小鼠保护作用的研究食量和进食量升高，空腹血糖值升高 60%（如图 2-1D）。结果表明，单独的镉处理和单独的高脂高糖饮食处理时，都会影响小鼠的正常生活状况，但短时间内不会形成疾病反应。当镉和高脂高糖饮食共同处理时，小鼠表现出精神状态萎靡，毛色暗淡且伴有油渍，追逐、攀爬等活动量减少以及“三多一少”症状。b. 不同形式损伤对小鼠糖、脂代谢的影响由图 2-2A 可以发现，与 Con 组的正常小鼠相比，HF 组血清中的 TC 水平显著升高2 倍（p<0.01）；Cd 组小鼠的 TC 水平升高 20%（p<0.05）。HF+Cd 组血清中的 TC 含量升高 1 倍（p<0.05），介于 HF 组合 Cd 组之间。可见高脂高糖饮食易造成血液中 TC 含量升高，但氯化镉和高脂高糖饮食共同诱导时，脏器损伤加重，紊乱的代谢机制会导致TC 含量波动较大。

功能评价指标,氯化镉,高脂,小鼠

陕西科技大学硕士学位论文20%（p<0.05）。提示氯化镉联合高脂高糖诱导可能会导致小鼠糖脂代谢紊乱，已具备DN 的基本特征。由图 2-2C 中可以看出，与 Con 组相比，HF 组 HDL 含量显著升高 26%（p<0.01），Cd 组 HDL 含量极显著降低 40%，HF+Cd 组的 HDL 含量极显著降低 70%（p<0.001）。说明氯化镉和高脂高糖饲料联合诱导时对小鼠的损伤程度最大。由图 2-2D 可以看出，与 Con 组相比，HF 组小鼠 LDL 含量升高 30%（p<0.05）；Cd组小鼠的 LDL 含量显著升高 1 倍有余（p<0.01）；HF+Cd 组小鼠 LDL 的升高量达到 4倍之多（p<0.001）。说明氯化镉联合高脂高糖饲料诱导的效果是单纯高脂高糖饲料和氯化镉诱导的总和。c. 不同形式损伤对小鼠肾功能的影响

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