抗HIV活性成分桑辛素代谢机制及药-药相互作用研究

发布时间：2020-07-06 08:55

【摘要】：一、研究背景与目的桑辛素是从桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮、树枝及桑葚中提取分离出的一种异戊烯基黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、镇痛、抗惊厥及抗炎等一系列的药理活性。2015年桑辛素被确定为全球首个纯天然抗HIV植物药复方SH中的标准质控成分。复方SH,又称“司艾特散”,是从20多种活性较强的中草药中选择了5味中药,按“君,臣,佐,使”的配伍原则,组方而成。对HIV的治疗有效率高达89%,可供HIV感染者长期服用,并于2012年8月正式获准在泰国销售。成为我国第一个在国外获得新药证书并上市的纯天然抗HIV植物药,开创了中草药治疗HIV的先河。桑辛素作为复方SH中“君药”桑白皮的主要药效成分,推测其在抗HIV病毒方面也可能具有卓越的药效,目前尚无有关桑辛素抗病毒药效方面的报道。另一方面,桑辛素为5,2',4'-三羟基黄酮,分子中具有多个游离的酚羟基,极易受葡萄糖醛酸转移酶催化发生II相结合反应,该类反应也是黄酮类化合物的主要代谢途径。目前,有关桑辛素的代谢机制缺乏深入的研究,之前的研究仅对桑辛素的CYP代谢进行了简要研究,对其葡萄糖醛酸化代谢尚无文献报道。尽管已有LC-MS/MS方法应用于血浆中桑辛素的测定,但是其代谢物在体内的药代动力学特点尚无研究报道。充分了解药物的体内处置过程对于阐明药物的药效作用和显效机制具有重要的意义。因此,本课题:(1)首先对桑辛素本身的抗HIV药效进行了研究,确定其药理活性,为其成为新的抗HIV治疗药物的成药性研究提供必要的研究基础。(2)系统研究桑辛素的代谢机制及其药代动力学特征,阐明其在体内的主要暴露形式和水平,有利于预测药物的疗效和潜在的毒性反应,对其药物成药性发展和临床应用具有十分重要的意义。此外,目前HIV在临床上的治疗方法通常为多种药物联合使用的鸡尾酒疗法(HAART疗法),但长期服用会产生严重的毒副反应,并且导致大量耐药毒株出现。中药治疗HIV具有作用平和而持久、提高机体免疫功能、毒副作用小、不易产生耐药性、价格便宜、适合国情、患者依从性好、能够长期服用等特点。因此,采用中西药的联合疗法治疗HIV已经成为新的治疗趋势,具有广阔的发展前景。桑辛素作为潜在的抗HIV天然产物,当它与其他化学药物联合应用时,由于其在体内具有广泛的代谢,必须考虑代谢相关的药物相互作用。从而有助于优化给药剂量和避免毒副作用,为临床用药的安全和有效性提供重要的理论依据。在本论文中,我们采取了体内、体外和在体多种实验模型对桑辛素的代谢机理及基于代谢的药药相互作用进行了深入研究。首先,我们采用TZM-bl细胞研究了桑辛素对HIV-1SF162感染的抑制活性,并以临床上常用的抗HIV化学药物替诺福韦作为阳性对照,考察方法的可靠性,并与桑辛素的抗HIV活性作对比。接着,采用大鼠在体肠灌流模型研究了桑辛素在大鼠肠道的吸收与代谢特征,并收集胆汁了解药物的排泄情况。采用重组人源化CYP纯酶,UGT纯酶以及特异性化学抑制剂对桑辛素进行体外代谢孵育,确定参与其代谢反应的主要酶亚型。通过研究桑辛素在人肝微粒体,鼠肝微粒体及主要代谢酶中的酶代动力学特征,阐明桑辛素的代谢机理。最后,建立了一个同时检测桑辛素原型和主要代谢产物的快速灵敏的LC-MS/MS方法。运用此方法,考察了桑辛素口服给药SD大鼠药代动力学实验,阐明桑辛素口服后在体内的主要暴露形式和水平。同时考察桑辛素与抗HIV化学药物联合使用时的药药相互作用。研究当药物联用时,与各药物单独给药时相比,血浆药物浓度-时间曲线与主要药代动力学参数的变化。二、实验方法1.桑辛素体外抗HIV药效研究采用TZM-bl细胞,考察桑辛素对HIV-1SF162感染的抑制活性,计算药物对病毒的抑制率。并以抗HIV化学药物替诺福韦作为阳性对照。2.桑辛素在大鼠肠道的吸收与代谢研究采用大鼠在体肠灌流模型,收集肠道灌流液和胆汁样品,分析桑辛素在大鼠肠道中的吸收与代谢特点。并将桑辛素与人肠微粒体和制备的大鼠各肠段微粒体共同孵育,研究桑辛素在肠道的代谢特征。3.桑辛素的体外代谢机理研究采用9种重组人源化CYP纯酶,12种UGT纯酶以及特异性化学抑制剂对桑辛素进行体外代谢孵育,研究介导桑辛素代谢的主要酶亚型。比较桑辛素在人肝微粒体,鼠肝微粒体及主要代谢酶中的酶代动力学参数,阐明桑辛素的代谢机理。4.桑辛素的药代动力学研究采用SD大鼠药代动力学模型,研究桑辛素灌胃给药大鼠后(8mg/kg和16 mg/kg)的药代动力学特点。以LC-MS/MS检测大鼠血浆中的桑辛素及其主要代谢物的含量,绘制相应的药时曲线,用WinNonlin(?)3.3非房室模型计算主要药动学参数。5.桑辛素与抗HIV化药的药药相互作用采用SD大鼠药代动力学模型,给大鼠灌胃给药2种药物(桑辛素和抗HIV化学药物),测定血浆中药物及代谢物的浓度。研究当2种药物联合给药时,与各药物单独给药组相比,药时曲线与主要药代动力学参数的变化。三、实验结果1.桑辛素体外抗HIV药效研究桑辛素对HIV-1SF162感染具有显著的抑制活性,其IC50=5.27μM。作为阳性对照组的替诺福韦,IC50 = 2.64 μM。2.桑辛素代谢产物的鉴定通过UPLC-MS/MS质谱分析结合紫外光谱峰偏移法,鉴定了 4个桑辛素Ⅱ相代谢产物(M-5-G,MⅡ-2,M-4'-G和M-2'-G)及2个I相代谢产物(MⅠ-1和MⅠ-2)。3.桑辛素在大鼠肠道中的吸收和代谢通过大鼠在体肠灌流实验,表明十二指肠和空肠是桑辛素在肠道的主要吸收和代谢部位,吸收方式为被动扩散。M-4'-G是桑辛素在肠道生成的最主要的代谢物。4.桑辛素的CYP和UGT代谢机理研究通过化学抑制剂和重组人源化纯酶实验,表明在桑辛素的CYP代谢中,CYP3A4,3A5和2C19是最重要的代谢酶,其次是CYP2B6,2C9,2D6和1A2,CYP2C8和2E1几乎不参与桑辛素的CYP代谢。在桑辛素的葡萄糖醛酸化代谢中,UGT1A1,1A3,1A7和2B7是介导反应的主要酶亚型。5.桑辛素在大鼠体内的药代动力学研究本课题建立了可同时检测大鼠血浆中桑辛素原型及4种代谢物的灵敏、可靠的UPLC-MS/MS定量分析方法。口服给药后(8和16mg/kg),桑辛素在大鼠胃肠道中迅速吸收入血并被转化为4种代谢产物,包括3个单葡萄糖醛酸苷和1个羟基化代谢产物,即M-5-G,MⅡ-2,M-4'-G和MⅠ-t。桑辛素原型在大约30~40min左右达峰并在48h完全消除,Cmax和AUC0-t分别为299.12 ±119.52 ng/mL和98.32 ± 21.13 min·μg/mL(16 mg/kg组)。代谢物中,M-4'-G的血药浓度要远远高于其它3个代谢物,AUC0-t是其它代谢物的10倍以上,是桑辛素在体内最主要的代谢产物。M-5-G,M-4'-G和MⅠ-1的药时曲线趋势一致,均在60 min内达峰,随后逐渐消除。但MⅡ-2的药时曲线明显不同,达峰时间很晚(672~800 min),导致MⅡ-2消除时间和在体内的滞留时间均较长,在给药后36 h的血浆中仍可检测到。两个给药剂量组的桑辛素原型和代谢物均存在明显的双峰现象,推测可能是由于存在肝肠循环导致的。6.桑辛素与抗HIV化药的药药相互作用本章考察了桑辛素与抗HIV化药一起口服后,对桑辛素以及抗HIV化药各自的药代动力学特征的影响。首先,我们考察了阿扎那韦硫酸盐对桑辛素药动学特征的影响。结果表明:当桑辛素与阿扎那韦硫酸盐联合给药时,阿扎那韦硫酸盐会显著影响桑辛素的药动学特征,导致桑辛素的Cmax和AUCo-t显著增高,增加至1.54倍。各代谢物的Cmax也显著增加,增加至1.4~2倍。随后,我们又考察了桑辛素对抗HIV化学药物阿扎那韦硫酸盐和依法韦仑的药动学行为的影响。结果发现,桑辛素对阿扎那韦硫酸盐药动学影响较小,仅发现阿扎那韦的Cmax增高至1.32倍,其余药动学参数无明显改变。但是当桑辛素与依法韦仑联用时,会产生明显的药-药相互作用,使依法韦仑的Cmax和AUCo-t分别增加至2.22和1.62倍,MRTO-t也显著降低,差异具有统计学意义。四、结论1.本研究首次考察了桑辛素本身的抗HIV药效,发现桑辛素对HIV-1SF162感染具有显著的抑制活性,IC5O= 5.27 μM,并且对细胞没有明显的毒性作用。提示桑辛素可能成为一个潜在的抗HIV天然产物候选单体,具有良好的开发应用前景。2.在本实验中,我们采用了体外、在体和体内实验联合的方法研究桑辛素的代谢机理和药代动力学特征,并发现各数据有良好的相关性。桑辛素口服后在体内能迅速转化为代谢产物,血浆中除了原型药物外,还含有3个单葡萄糖醛酸苷(M-5-G,MII-,M-4'-G)和1个羟基化代谢产物(MI-1),其中M-4'-G是最主要的代谢产物。桑辛素的葡萄糖醛酸化代谢主要是由UGT1A1,1A3,1A7和2B7介导,CYP代谢主要由CYP3A4,3A5和2C19介导。全面的代谢机理和药动学考察或对桑辛素的体内药效研究提供新的视角和理论依据,可为其提高生物利用度提供新的思路和方法。3.通过考察桑辛素与抗HIV化药联合给药时的药药相互作用,我们发现阿扎那韦硫酸盐可显著影响桑辛素的药动学行为,使桑辛素的Cmax和AUC0-t增加至1.5倍,各代谢物的Cmax和AUC0-t也呈增高现象。而桑辛素对阿扎那韦硫酸盐的药动学影响较小,仅发现阿扎那韦的Cmax增高至1.32倍。但是当桑辛素与依法韦仑联用时,会产生明显的药-药相互作用,使依法韦伦的Cmax和AUC0-t分别增加至2.22和1.62倍。这些结果表明当桑辛素作为新的抗HIV天然产物在临床上与阿扎那韦硫酸盐或依法韦伦合用时,会发生明显的药-药相互作用,提高药物的血药浓度,增强药效。应注意调整临床给药剂量,避免毒副作用的产生。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

是从桑科植物桑Ｌ．的干燥根皮、树枝及桑葚中提烯基黄酮类化合物［１，２］，化学结构如图１－１，为５，２＇，邋４１－三羟［３］、抗菌［４］、抗氧化、镇痛［５］、抗惊厥及抗炎等一系列的药理活理学研宄表明，桑辛素对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作颈癌［９］、乳腺癌［１（），１１］、前列腺癌［１２］、肝癌［１３］及胶质母细胞瘤抗肿瘤活性外，桑辛素还被确定为全球首个纯天然抗ＨＩＶ植标准成分［１７］，推测其在抗ＨＩＶ病毒方面也可能具有卓越的化合物作为一类在自然界中广泛分布的多酚类物质，体内化合物具有显著的药效，然而开发成治疗药物或预防药物少，主要原因是黄酮类化合物在体内可发生广泛的Ｉ相和ＩＩ物利用度较低（＜邋７％）邋［％２１］。因此，研宄该类化合物在体对其药物开发至关重要。逡逑

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本文编号：2743426