华蟾毒它灵通过下调β-catenin抑制肝癌细胞的上皮间质转化

发布时间：2020-07-06 13:28

【摘要】：实验目的:肝癌是全世界范围内与癌症相关的最常见的死亡原因之一。肝癌术后复发率及转移率较高,患者的预后较差,而中国是肝癌高发区。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肝癌转移中扮演关键角色,与肝癌侵袭、肝内转移及低存活率密切相关。因此,抑制肝癌细胞发生EMT具有重要意义。华蟾毒它灵(Cinobufotalin)是中药蟾酥的主要成分之一,具有广谱的抗肿瘤活性。本实验的目的是探讨cinobufotalin能否抑制肝癌细胞的EMT和转移,并初步探讨其分子机制。实验方法:本实验采用CCK-8法检测cinobufotalin对肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞增殖的影响;用倒置显微镜观察cinobufotalin对细胞形态学的影响;Western blotting实验检测cinobufotalin对两种肝癌细胞EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin、Slug、ZEB1)和迁移相关蛋白(β-catenin、DKK1、MMP7)表达的影响;wound healing实验、transwell迁移实验和transwell侵袭实验评价cinobufotalin对肝癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响;用荧光定量PCR法和western blotting法检测cinobufotalin对肝癌细胞中β-catenin基因表达和其细胞浆与细胞核中β-catenin蛋白表达量的影响;采用瞬时转染法,构建β-catenin过表达和β-catenin敲减的Hep G2和SMMC-7721细胞模型。基于上述细胞模型,检测β-catenin在cinobufotalin调控Hep G2和SMMC-7721细胞EMT中的作用;建立BALB/c小鼠肺转移瘤模型,在动物水平评价cinobufotalin对肿瘤细胞EMT和转移的影响;通过免疫组化实验,检测小鼠肺肿瘤灶中EMT相关蛋白的表达。实验结果:1、CCK-8实验结果表明,cinobufotalin抑制Hep G2和SMMC-7721细胞的增殖并呈时间依赖性和剂量依赖性。2、用cinobufotalin处理肝癌细胞24 h后,可以发现在给药前后,细胞形态从纺锤形的间充质样形状转变为椭圆形的上皮样形状。3、Western blotting实验结果表明,在肝癌细胞中cinobufotalin能显著影响EMT相关蛋白的表达,即上调上皮标志蛋白E-cadherin的表达,抑制间充质标志蛋白Vimentin、ZEB1、Slug、Snail和N-cadherin的表达。4、Wound healing、transwell迁移和侵袭实验的实验结果显示,cinobufotalin能显著抑制肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。5、实时荧光定量PCR实验和western blotting实验结果表明,cinobufotalin显著降低β-catenin mRNA和蛋白的表达,并抑制β-catenin核蛋白的表达。6、本实验成功构建了β-catenin过表达的肝癌细胞株模型。Western blotting实验结果表明,β-catenin过表达可促进肝癌细胞株的EMT活性,而cinobufotalin能逆转过表达β-catenin对EMT相关蛋白的调控作用。Wound healing、transwell迁移和侵袭实验结果显示,cinobufotalin明显逆转了过表达β-catenin对肝癌细胞迁移和侵袭能力的诱导作用。7、本实验成功构建了β-catenin低表达的肝癌细胞株模型。本部分实验的实验结果显示,在Hep G2和SMMC-7721细胞中,β-catenin低表达显著抑制细胞株的EMT活性及迁移与侵袭能力,且cinobufotalin使该抑制作用增强。8、动物实验结果表明,cinobufotalin显著抑制BALB/c小鼠肿瘤肺转移灶的形成和转移。9、免疫组化实验结果显示,在动物水平,cinobufotalin抑制肿瘤发生EMT。实验结论:Cinobufotalin通过下调β-catenin的表达抑制肝癌细胞发生EMT,进而抑制肝癌细胞的转移和侵袭。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

亚型,肝细胞,癌细胞

图 1-1：EMT 的三种亚型[23]原发肿瘤中分离出癌细胞，然后使癌细胞侵入邻近组织并胞侵袭和转移的重要机制[25,26]。据报道，约 90%的癌症死亡有越来越多的证据表明，EMT 与癌细胞的侵袭、迁移和自要联系[29]。脏中，肝细胞间彼此粘附且极化并呈现出上皮细胞的特征，细胞，健康的肝细胞是缺乏基底膜的。因此，健康、成熟的位于窦周间隙（Disse 间隙）的肝星状细胞分离。当发生肝强，并且由于将肝细胞从肝血窦分离的膜屏障的缺乏使肝肿Chen 等人[31]的研究阐述了恶性肝细胞变得更加具有迁移性L 的扩增可以导致 ARHGEF9 的激活和小 GTP 结合蛋白 C使肿瘤肝细胞穿过 Disse 间隙，侵入邻近的血管并随血液循外（图 1-2）。Lee TK[32]和 Battaglia S[33]分别提出，培养肝

图 1-2：肝癌和 EMT[30]1.2.2 β-catenin 在 EMT 过程中扮演重要角色β-catenin 蛋白由位于染色体 3p21~22 的 CTNNb1 基因编码，C 端由负责靶基因转激活的氨基酸残基构成，N 端由富含 Thr/Ser 位点的氨基酸残基组成。当胞质中β-catenin 蓄积到一定量后，β-catenin 进入细胞核并与 TCF/LEF-1 转录因子结合形成复物，启动与肿瘤侵袭和转移相关的靶基因如 c-Myc、MMP7 等[35,36]，进而诱导肿瘤发EMT。当胞质中聚集的 β-catenin 入核后 E-cadherin 游离分散，从细胞连接处重新分到其他的区域，从而降低了细胞间粘附能力，并伴随着下调上皮标志物 E-cadherin 的达，上调间质标志物 Vimentin 的表达，进而促使上皮细胞转化为间充质细胞，促进了细胞的 EMT 进程，增加肿瘤细胞转移侵袭的可能性[37-40]。β-catenin 也是 Wnt 信号通中的关键因子，在调节细胞增殖和分化中起着重要作用[41,42]。β-catenin 与肿瘤发生发展密切相关[43,44]，在肠上皮组织及其他组织中，β-cateni

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