基于网络药理学的托里消毒散精简方促糖尿病创面血管新生的分子机制研究

发布时间：2020-07-11 02:15

【摘要】：目的观察含有黄芪、当归、白芷、皂角刺4味药物的托里消毒散精简方对糖尿病大鼠创面血管新生的影响;分析方中所含有的化学成分,明确该方药效物质;运用网络药理学方法探讨该方促糖尿病大鼠创面血管新生的靶点与潜在作用机制并进行验证。方法1.通过尾静脉单次大剂量注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,背部皮肤打孔法制备糖尿病大鼠皮肤创伤动物模型,随机分为正常对照组(NC组)、模型组(DM组)及托里消毒散精简方治疗组(DM+TLXDS组)。计算创伤后5d、8d、11d、14d各组大鼠创面愈合率。分别取创伤后5d、8d、11d、14d各组大鼠创面组织,HE染色观察创面组织形态学变化。免疫组织化学检测创伤5d后创面组织中Ki67及CD31的表达情况。2.UPLC-Q-TOF/MS对托里消毒散精简方中所含有的化学成分进行快速分析。分子对接技术对药物作用的靶蛋白进行预测,Uniprot、KEGG等相关数据库对靶蛋白的功能及通路进行注释,利用Cytoscape软件构建药物成分-靶点-功能网络图。3.体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),通过CCK-8实验检测不同浓度的药物成分对细胞活性的影响;应用Western Blotting法检测药物成分对血管新生相关信号通路蛋白表达的影响。结果一、动物实验结果1.各组大鼠创面愈合率:大鼠造模后,DM组大鼠各时间点创面愈合率均低于NC组(P0.05),DM+TLXDS组大鼠创面愈合率在给药2天后即明显高于DM组,在药物干预期间糖尿病各组大鼠血糖均未见明显差异。2.创面新生血管生成情况:免疫组织化学染色结果显示与NC组大鼠相比,DM组创面内皮细胞增殖标记物Ki67和血管内皮特异性标记物CD31表达均明显降低,DM+TLXDS组大鼠创面中Ki67及CD31的表达较DM组明显增多。二、网络药理学分析结果1.UPLC-Q-TOF/MS药物成分分析:在正、负离子模式下从托里消毒散精简方醇提物中共指认出包含黄酮、皂苷、香豆素、甾体类及萜类等成分的28个化合物。2.分子对接及网络药理学分析:分子对接结果表明方中所含有的17个化合物可与17个靶蛋白相互作用,成分-靶点关系共计210对。其中与免疫调节相关的靶点5个,与抗菌、抗炎作用相关的靶点6个,与细胞分化相关的靶点6个,与细胞迁移相关的靶点10个,与血管新生相关的靶点6个,与上皮生长因子刺激相关的靶点2个,与血管的舒张功能相关的靶点6个,与雌激素相关的靶点2个。进一步的网络药理学分析显示托里消毒散精简方中所包含的黄酮、皂苷、香豆素、甾体类及萜类成分可通过调节NF-kB、MAPK、PI3K、ERK2等靶点进而调节NF-kB、PI3K/Akt/eNOS、MAPK等相关信号通路从而共同产生抗菌、抗炎、免疫调节及促血管新生等生物学效应。三、细胞实验结果黄芪皂苷IV、毛蕊异黄酮、紫花前胡苷对PI3K/Akt/eNOS信号通路蛋白表达的影响:Western Blotting结果显示黄芪皂苷IV增加了HUVEC中PI3K蛋白的表达水平,紫花前胡苷可调节其下游Akt蛋白的磷酸化水平,毛蕊异黄酮则可调节eNOS蛋白的磷酸化水平。结论1.托里消毒散精简方可通过促进糖尿病大鼠创面的血管新生有效改善创面的愈合。2.托里消毒散精简方中黄酮、皂苷、香豆素、甾体类及萜类成分可能为该方主要的药效物质,这些成分可能通过调节免疫、抗炎、促血管新生等作用进而促进糖尿病大鼠创面的愈合。3.黄芪皂苷IV、毛蕊异黄酮及紫花前胡苷对PI3K/AKt/eNOS通路相关蛋白的调节可能为该方促创面血管新生的分子机制之一。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

修复过程,创面,糖尿病

2图 1 创面的修复过程1.2 糖尿病创面愈合受损内源性的病理异常与外在因素（感染、压力等）共同导致了糖尿病创面复杂的微环境[8]。大量的文献资料均证实了糖尿病创面修复能力下降、愈合延迟[9-11]。糖尿病异常的血流动力学首先会引起微循环的障碍，长期慢性的高糖环境导致微血管形态结构与功能的异常，其中以毛细血管基底膜增厚、管腔缩小及周细胞的退化、缺失为主要表现[12]。增厚的基底膜降低了白细胞的迁移，增加了糖尿病创面对感染的易感性。此外，血管结构的改变同样降低毛细血管壁的弹性，影响了血管的舒张能力。在长期的高糖环境中细胞代谢及功能发生紊乱，皮肤中非酶促糖基化反应的终产物 AGEs 含量增多，其经与受体 RAGE 相结合可引起一系

创面愈合,大鼠,创面

图 1.2.3 各组大鼠创面愈合率1.2.4 大鼠创面组织 HE 染色各组大鼠取创伤后 5、8、11、14 天创面组织进行观察，镜下 HE 染色显示创伤后 5 天 NC 组大鼠创面新生血管旺盛；DM 组创面可见一层细胞核致密的炎症坏死组织，下方新生血管较少；DM+TLXDS 组创面血管新生较为丰富。创伤后第 8 天 NC 组大鼠创面炎性细胞渐消退，新生血管向创面表层延伸，管腔内含有大量的红细胞，新生表皮渐向创面中央爬行；DM 组较 NC 组创面炎症反应仍重，但新生血管变得丰富，管腔较大，大量的红细胞位于管腔中，表皮修复较差。DM+TLXDS 组创面中血管渐向表层延伸，管腔中有较多的红细胞，新生表皮变厚。创伤后 11 天 NC 组大鼠创面血管渐闭合、退化，血管数较 8 天时少，大部分创面被成纤维细胞所合成的胶原基质成分所替代；DM 组大鼠创面仍遗留有部分炎性细胞，新生血管较 8 天时少，血管向表层延伸，血管中的红细胞数量变少，表皮修复程度差于 NC 组；DM+TLXDS 组大鼠创面可见散在炎性细胞，创面中新生血管渐向表层延伸，管腔缩小，表皮修复较佳。创伤后 14 天 NC 组创面可见大量的胶原基质成分，血管数进一步减少，表皮变厚；DM 组仍有大部分

创面,创伤后,HE染色,大鼠

创面未被修复，创面中渐向表层延伸的血管数增加，大部分管腔中未见明显的红细胞，创面胶原基质成分沉积欠佳；DM+TLXDS 组创面血管退化，胶原基质沉积情况好于模型组，表皮变厚进一步覆盖创面。(结果见图 1,2,3,4)

【参考文献】