雷公藤红素在骨关节炎中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-13 04:45

【摘要】：研究背景:骨关节炎(Osteoarthritis OA)又称退行性骨关节病,是最常见的一种关节紊乱性疾病,在世界范围内影响着成千上万的患者,在中老年人群中尤为多见。有报道指出,到2020年,美国骨关节炎人口将达到5000万人,占成年人人口的25%。据2018年中华骨科杂志发布的《骨关节炎诊疗指南》统计,我国65岁以上人群50%以上为骨关节炎患者,累及的部位包括髋、膝、踝、手及颈腰椎等关节,我国膝关节症状性骨关节炎患病率达到8.1%,而且随着我国人口老龄化进展的加速,骨关节炎的患病率还有逐渐增高的趋势,严重影响中老年人的健康与生活质量,给我国国民经济和社会发展带来了巨大负担。骨关节炎病变主要是在生物学与力学因素共同作用下破坏软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨合成与降解的平衡,导致关节软骨的退变纤维化、软骨下骨硬化、周围骨质增生、关节间隙变窄以及滑膜炎等,其中最重要环节是关节软骨的退变。许多研究证实IL-1β能够阻断软骨细胞在ECM成分中合成,干扰关键结构蛋白的合成,如Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白多糖。软骨细胞受到IL-1β刺激后,往往迅速衰老或逐渐凋亡,可以观察到IL-1β对软骨有多方面影响,包括抑制其修复的可能性、通过酶加速软骨退化和直接对软骨细胞产生副作用,因此IL-1β被广泛应用作为诱导软骨细胞炎症反应的体外模型。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类酶活性依赖于锌离子的中性蛋白酶超家族。在关节软骨破坏中起重要作用的主要是MMP-3、MMP-9和MMP-13,它们主要是由软骨细胞、滑膜细胞、炎性细胞和巨噬细胞分泌,它们均参与了破坏软骨基质,致使胶原暴露于破坏胶原的酶并激活酶的活性,导致胶原的网状结构破坏,最后使其破裂分解。Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ)和聚蛋白多糖(Aggrecan)是软骨基质中主要成分,其表达和凋亡可以作为反应软骨退变程度的指标,其活性的降低将导致ECM再生紊乱,最终导致软骨退化。SDF-1是由滑膜产生,而CXCR4主要由关节软骨表达。最近的研究明确表明SDF-1/CXCR4信号在OA的病变过程中也起着至关重要的作用。体外研究表明,SDF1和CXCR4相互作用是通过上调MMPs表达刺激了人类软骨细胞的分解代谢活动。有实验表明在OA患者滑液中的SDF-1水平出现升高,但可以通过滑膜切除手术减少其表达,这进一步证实了 SDF-1/CXCR4参与了 OA的进展,也有学者通过基因操作或药理阻断下调SDF-1/CXCR4表达,在体外能强有力的减弱人软骨细胞的ECM退化,并能改善动物模型中OA,这些研究结果表明,SDF-1是通过刺激MMPs表达来影响软骨细胞和基质改变的,从而提出抑制SDF-1/CXCR4信号通路是一个治疗OA潜在药物作用靶点。临床上OA的早期治疗以基础治疗和药物治疗为主,虽然可以减轻疼痛、缓解部分症状,但尚不能延缓疾病的进展,且口服药物还存在不可忽视的副作用,如潜在的损害消化系统和心血管系统风险等。虽然人工关节置换术作为一种可以真正阻断OA进展达到临床治愈的措施,但由于人工关节材料磨损、价格昂贵以及手术风险等并发症的存在,其目前主要适用于症状严重的晚期OA患者。对于早、中期OA患者,仍然缺乏有效干预疾病进展的方式。因此,深入研究骨关节炎相关发病机制和治疗方法有着十分重要的现实意义及价值。雷公藤红素是一种从雷公藤根部提取的醌甲基三萜化合物,因抗癌和抗炎作用受到广泛关注。以前的报告清楚地证实了雷公藤红素能够调节各种转录因子、信号通路、粘附分子、细胞因子和趋化因子,包括CXCR4。与雷公藤红素在癌症和炎症中的有益作用一致,在实验室和临床中都能观察到雷公藤红素对不同形式的关节炎具有强有力的疗效。在之前的报道中,Yadav等人在实验中发现雷公藤红素具有通过下调CXCR4的表达来抑制癌细胞的侵袭和转移的潜力。同样,雷公藤红素在缺氧条件下通过抑制CXCR4抑制成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)的迁移和侵袭,从而改善RA。其他报道也揭示了雷公藤红素对MMPs和炎性细胞因子的抑制作用,这些都可能参与关节炎的病理过程。总之,这些结果为雷公藤红素治疗RA患者提供了机制上的依据,然而,关于雷公藤红素在OA病理过程中具体调节功能的数据有限。考虑到SDF-1/CXCR4在OA进展中的关键作用,我们有理由推测雷公藤红素作为一种影响SDF-1/CXCR4的中草药产品,在OA治疗中具有显著的疗效及无限的应用潜力。因此我们有必要进行了一些相关实验来探讨雷公藤红素在OA中的作用及机制。第一部分雷公藤红素抑制骨关节炎软骨细胞的炎症反应及分解代谢目的:观察雷公藤红素对体外培养的大鼠关节软骨细胞的毒性作用;观察雷公藤红素拮抗IL-1β介导的软骨细胞炎症反应及分解代谢作用。方法:取4周龄SD大鼠股骨头关节软骨细胞体外分离培养传至第3代,并用番红O染色及Ⅱ型胶原荧光免疫荧光法进行软骨细胞的鉴定;雷公藤红素处理大鼠软骨细胞后,用细胞计数活性法(CCK-8)检测雷公藤红素对软骨细胞活性的影响;用雷公藤红素干预IL-1β(10ng/ml)刺激的软骨细胞,用实时定量PCR法检测细胞内MMP-13、ADAMTS-5基因的表达变化,并提取细胞蛋白,采用Western blot法检测软骨细胞中MMP-13、ADAMTS-5表达变化,从蛋白水平进一步验证;收集软骨细胞上清液,采用ELISA法检测炎性因子COX-2及iNOS的浓度变化。用雷公藤红素处理大鼠软骨细胞,采用实时定量PCR法检测细胞内Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan基因的表达。结果:1.成功分离并培养大鼠软骨细胞,经番红O染色及Ⅱ型胶原免疫荧光鉴定提取的细胞为软骨细胞。2.通过CCK8检测发现:雷公藤红素在0.2μM-1.2μM浓度范围内,对软骨细胞无明显毒性作用;其中0.8μM浓度的雷公藤红素对软骨细胞的活性较好。3.雷公藤红素抑制MMP-13和ADAMTS-5表达,同时抑制炎症因子COX-2和iNOS表达。4.雷公藤红素可以促进Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan的基因表达。结论:1.雷公藤红素在0.2μM-1.2μM浓度范围内,对软骨细胞无明显毒性作用;0.8μM浓度的雷公藤红素对软骨细胞的活性较好。2.雷公藤红素对OA软骨细胞具有抗炎抗降解的作用;雷公藤红素可以在一定程度上促进软骨细胞外基质修复作用。第二部分雷公藤红素延缓大鼠骨关节炎进展目的:以单碘乙酸盐(MIA)诱导的大鼠OA模型为研究对象,观察雷公藤红素治疗OA前后,大鼠关节疼痛和软骨损伤的变化;探讨雷公藤红素在大鼠OA中对MMPs、COMP fragment、Ⅱ 型胶原蛋白、Aggrecan 的影响。方法:24只重约200-220g的SD大鼠随机分为4组,Sham组、OA组、雷公藤红素低剂量组、雷公藤红素高剂量组,每组6只,我们采用MIA诱导OA大鼠模型;在造模后的第二天关节腔内注射不同剂量的雷公藤红素,连续注射14天,在第0、7、14天通过行走距离、站立次数、后爪重量分布的变化来评估造模前后及治疗前后大鼠骨关节炎疼痛的变化;并采用实时定量PCR检测疼痛基因CCR-2和MCP-1表达变化;在治疗后第14天取股骨髁膝关节标本,并用福尔马林固定后进行脱钙、脱水及蜡块制作,制片成功后使用番红O染色并采用OOCHAS评分系统观察关节软骨的改变;对大鼠血清中的COMP fragment进行Elisa检测,并在组织切片进行了 COMP fragment的免疫组化染色,观察雷公藤红素是否可以抑制COMP降解;应用免疫组化检测MMP-13表达变化,并采用Western blot法检测不同剂量的雷公藤红素对MIA诱导的OA大鼠模型中MMP-3、MMP-9、MMP-13、Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan的表达情况;结果:1.大鼠关节腔内注射MIA后,OA组较Sham组的行走距离、站立次数明显减少,后爪重量分布显著减少(P0.01);注射雷公藤红素组与OA组相比,在第7天和14天观察雷公藤红素组的行走距离、站立次数明显增多,后爪重量分布明显升高(P0.01);疼痛基因CCR-2和MCP-1的表达雷公藤红素治疗组明显低于OA组(P0.01),且具有剂量依赖性。2.软骨组织番红O染色:Sham组关节软骨的番红O染色无明显减退,潮线完整;软骨细胞数量及排列正常;蛋白多糖(PG)含量正常;OA组关节可见软骨细胞数量明显减少,局部细胞排列紊乱不规则,蛋白多糖(PG)含量明显减少;雷公藤红素注射组可见局部软骨细胞明显增多,排列较整齐,蛋白多糖(PG)含量明显增加。OA组的OOCHAS评分明显高于正常组,而雷公藤红素组的OOCHAS评分明显比OA组低,差异有统计学意义(P0.01)。3.雷公藤红素治疗组大鼠关节炎模型中血清COMP fragment浓度低于OA组。4.组织切片进行免疫组化染色,结果显示雷公藤红素治疗组COMP fragment、MMP-13 均少于 OA 组。5.雷公藤红素能明显抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达,且雷公藤红素高剂量组(2mg/kg)较低剂量组(1mg/kg)抑制效果更明显,差异有统计学意义(Cell:P0.01,Ce12:P0.05,与 OA 组相比)。6.雷公藤红素能够上调Ⅱ型胶原蛋白、Aggrecan的蛋白表达,差异有统计学意义(Cell:P0.01,Ce12:P0.05,与OA组相比),且有剂量依懒性。结论:雷公藤红素能够减轻大鼠OA疼痛症状及软骨损伤,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的表达,上调Ⅱ型胶原蛋白、Aggrecan的蛋白表达,减轻软骨细胞外基质降解,从而延缓大鼠OA进展。第三部分:雷公藤红素抗骨关节炎相关机制的体内及体外实验研究目的:探讨雷公藤红素对OA动物模型和IL-1 β介导的软骨细胞抗炎抗降解作用的分子机制。方法:我们体内实验以MIA诱导的大鼠OA为研究对象,采用Western blot方法检测Sham组、OA组以及不同剂量雷公藤红素组中SDF-1和CXCR4表达水平;体外实验为取4周龄SD大鼠股骨头关节软骨细胞体外分离培养传至第3代,加入不同浓度的雷公藤红素干预,用IL-1β(1Ong/ml)刺激的软骨细胞,用PCR法检测不同浓度雷公藤红素干预后软骨细胞中CXCR4表达水平变化;通过慢病毒转染使软骨细胞中CXCR4过表达,用PCR法检测ECM降解酶MMP-13和ADAMTS-5的信使RNA水平的变化。结果:1.雷公藤红素抑制OA大鼠模型软骨组织中SDF-1和CXCR4的表达,且雷公藤红素高剂量组较低剂量组抑制作用更明显;2.雷公藤红素抑制IL-1β刺激的软骨细胞中CXCR4的基因表达,其浓度越高,雷公藤红素抑制CXCR4作用越明显。3.通过慢病毒转染使软骨细胞过表达CXCR4基因,结果显示:1)在CXCR4正常表达的前提下,经雷公藤红素干预后,软骨细胞中MMP-13和ADAMTS-5的表达较未干预组明显降低;2)在同等剂量雷公藤红素干预的前提下,在过表达CXCR4基因组中雷公藤红抑制MMP-13和ADAMTS-5基因的能力较CXCR4基因正常表达组明显减弱;3)在不经雷公藤红素干预的前提下,过表达CXCR4基因组中,MMP-13和ADAMTS-5表达较CXCR4基因正常表达组明显升高。结论:1.雷公藤红素能够抑制大鼠OA模型中SDF-1和CXCR4的表达,且存在剂量依赖性;2.雷公藤红素能够抑制IL-1β介导的软骨细胞中CXCR4的表达,且存在浓度依赖性;3.雷公藤红素可通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路来降低MMP-13和ADAMTS-5的表达水平。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

番红,软骨细胞,免疫荧光法

２）．番红Ｏ染色鉴定软骨细胞逡逑番红０是碱性染料可与核酸结合显示红色，染色后我们可以看到细胞核粉红色（见图３）。逡逑图３：软骨细胞番红０染色（ｘ２００）逡逑３）邋．１１型胶原免疫荧光法鉴定逡逑ＩＩ型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用ＩＩ型胶原的免疫荧光对软逡逑骨细胞进行鉴定。荧光标记后，软骨细胞胞质ＩＩ型胶原表达阳性，呈红褐色荧逡逑光，细胞核不着色，为蓝色荧光，激光共聚焦显微镜下软骨细胞形态清晰可见。逡逑３３逡逑

软骨细胞,番红,碱性染料,粉红色

图２：原代软骨细胞（ｘ４０）逡逑２）．番红Ｏ染色鉴定软骨细胞逡逑

软骨细胞,胞质,雷公藤红素

图６：为图４和图５的重叠，胞质为红褐色荧光，胞核为蓝色荧光，细胞形态清晰２．雷么Ｖ藤红素对软骨细胞活性无影响逡逑我们采用经典的ＣＣＫ８法，探索不同浓度的雷公藤红素对大鼠软骨细胞的影响，参考既往的研究文献，我们选取的浓度范围为0．２ｈＭ邋－１．２ｎＭ。实验结逡逑果表明在０．２＾Ｍ邋－１．２ＭＭ浓度范围内的雷公藤红素对大鼠软骨细胞无明显毒性及逡逑抑制作用，各浓度孔与对照孔相比无统计学差异（Ｐ＞ａ0５）。经实验发现０．８ｆｉＭ逡逑浓度的雷公藤红素对软骨细胞的活性较好，因此后续实验我们选择了邋０．８ｐＭ组逡逑（见图７）。逡逑３４逡逑

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