大蒜中蒜氨酸的提取分离工艺及重结晶研究

发布时间：2020-07-13 19:28

【摘要】：大蒜自古以来就具有药食两用的功能,《本草拾遗》和明朝李时珍著《本草纲目》等对大蒜的药用特性都具详细记载。现代药理学研究发现,大蒜在防治心血管疾病、抗炎、抗微生物和抗肿瘤等方面具备显著功效。进一步的研究发现,其主要活性物质是大蒜中的蒜氨酸。蒜氨酸在大蒜体内是一种相对稳定的化合物,在大蒜组织破碎的情况下蒜氨酸与蒜酶接触,触发系列酶解反应,形成含硫化合物大蒜素等。后者很不稳定,常温条件下即降解为多种不具活性的物质。本文从新鲜大蒜出发,研究了高效获得大量高纯度蒜氨酸产品的工艺方法,以期对工业化生产提供参考。首先对高效液相测定蒜氨酸的方法进行了修订,确定了符合本实验的高效液相色谱条件为:流动相为乙腈:水(55:45),在210nm紫外吸收波长下检测,柱温控制在室温,流速为1.0mL/min,进样量为20μL。详细考察了蒜氨酸的提取工艺条件。第一个内容是对大蒜的预处理工艺实验条件的考察;第二个内容是对蒜氨酸的提取工艺条件考察。预处理采用正交试验法考察了微波灭酶处理下灭酶功率和灭酶时间对蒜氨酸酶灭活的影响,确定了在中火条件下灭酶60s的最佳条件。使用20%乙醇作为提取溶剂辅以超声波提取技术,通过单因素试验和响应面法优化得到了蒜氨酸的最佳提取条件:料液比为1:4.5,超声功率为67W,超声时间为1.7 h。通过对该工艺进行验证,发现蒜氨酸的提取率最高可达到91.8%。对蒜氨酸的分离纯化进行了研究。采用层析柱的方法对蒜氨酸进行分离纯化,考察了使用732型强酸性阳离子树脂对蒜氨酸进行分离的条件。最终确定了以下工艺参数:上样液浓度控制在3mg/ml左右,上样液流速为1.0 BV/h,该条件下蒜氨酸的吸附率可达到821.3mg/100g;确定氨水作为洗脱液,洗脱液浓度为0.30mol/L,洗脱液流速为1.0 BV/h。通过工艺验证,该分离条件下蒜氨酸纯度可达到64.3%。在等电点调节结合结晶和重结晶的方法对蒜氨酸进行精制。考察了结晶温度和溶剂对蒜氨酸结晶的影响。发现蒜氨酸在40℃条件下以60%乙醇溶液进行结晶,静置一定时间。重复进行三次,获得纯度可达到92%以上的蒜氨酸精制品。对蒜氨酸终产品分别采用了高效液相色谱法、红外光谱法和质谱法进行分析鉴别。结果都一致地认为:通过以上工艺方法获得的蒜氨酸产品在结构上与标准品一致。
【学位授予单位】：沈阳化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284.2
【图文】：

蒜氨酸,烯丙基,L-半胱氨酸,半胱氨酸

RAW264.7 细胞的炎症反应的抑制作用进行了研究。试验通过诱导一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的基因和蛋白质表达来调节一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）和炎症相关细胞因子的产生。结果发现蒜氨酸可以通过下调 NF-κB 的活性来抑制 iNOS 和 COX-2 的表达，最终达到抗炎的效果。Shi 等[9]通过 DSS 诱导小鼠炎症模型对蒜氨酸的抗炎活性进行了深入的研究。试验采用 qRTPCR 法检测检测炎症因子 mRNA 表达水平，和 Western blotting 法检测炎症因子蛋白表达或激酶活化情况。结果表明口服蒜氨酸组小鼠的 NO、MDA 和 MPO 含量均有所降低，iNOS、炎症因子、MAPK 及 PPAR-γ磷酸化表达水平均受到抑制。进一步研究发现蒜氨酸是通过调节 p38 和 JNK 的磷酸化来诱导 AP-1 、NF-κB 和 STAT-1 的活性的。植物学研究表明，蒜氨酸在大蒜体内的生物合成途径认为主要有以下两条：其一是谷胱甘肽中的半胱氨酸被烯丙基化，然后经过一系列步骤，生成蒜氨酸。在这个过程中同时也伴随着谷胱甘肽的降解；另一条途径是谷胱甘肽不直接参与反应，而是直接半胱氨酸烯丙基化，随后生成 S-烯丙基半胱氨酸，最后经过氧化生成蒜氨酸[10-11]。其主要步骤如图 1-1。

蒜氨酸酶,转化图,蒜氨酸

图 1-2 蒜氨酸酶解转化图Fig.1-2 Enzymatic conversion of alliin蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜）是大蒜中含量最高的具备一定药理活性的化合物，极易溶于水，不溶于纯无水乙醇、氯仿、丙酮、乙醚和苯。蒜氨酸具备旋光性，在水溶液中的旋光度为右旋 63.5 度。其等电点为 PI=48.6,在调节蒜氨酸溶液pH 值到等电点，改变溶剂极性的条件下可以得到白色针簇状结晶。可用于对蒜氨酸的精制[20]。1.2 蒜氨酸的含量检测方法研究现状在蒜氨酸的研究过程中，国内外对蒜氨酸的定性定量方法进行了较为广泛的开发。其中具有相对简单易行的定硫法以及现在普遍应用的色谱法。色谱法作为新兴的高效精确的检测手段，其应用被广泛普及。根据色谱柱交换分配原理的不同，将色谱法进一步细分为反向高压液相色谱法、高效离子交换色谱法、高效毛细管电泳法以及 HPLC-MS 连用法。在对色谱检测方法的开发过程中，逐步得到完善。开发了

甲醇,实验结果,乙腈

沈阳化工大学硕士论文实验结果与分析第三章实验结果与分析3.1 高效液相定量检测蒜氨酸实验结果3.1.1 流动相的优化与选择结果分别使用甲醇：水=30:70、乙腈：水=55:45、乙腈：甲醇：水=65:20:15 和甲醇：磷酸缓冲液（pH=5.5）=10:90 四中流动相进行试验，实验结果分别为图 3-1、图 3-2、图 3-3 和图 3-4。

【参考文献】