玉叶金花化学成分及抗炎活性研究

发布时间：2020-07-20 17:28

【摘要】：目的:以茜草科玉叶金花属玉叶金花(Mussaenda Pubescens Ait.f.)的干燥根和茎为研究对象,对其中的化学成分进行提取分离及鉴定,并对玉叶金花中4种化学成分的含量进行测定,明确其在玉叶金花中的含量,并对其进行体外抗炎活性进行筛选。本课题为进一步研究玉叶金花化学成分和生物活性筛选提供理论依据,为明确其抗炎活性打下基础,对开展玉叶金花的开发利用具有重要的科学意义。方法:对玉叶金花粗粉乙醇回流提取3次,回收溶剂得乙醇总提取物,总提取依次用石油醚,乙酸乙酯萃取,回收溶剂。选择玉叶金花乙酸乙酯部位和乙醇部位进行进一步分离,运用硅胶色谱、ODS色谱、MCI色谱、大孔树脂D101色谱,Sephadex LH-20色谱等分离纯化方法对化学成分进行分离纯化。对玉叶金花所得到的单体化合物利用HPLC对单体化合物纯度验证,通过LC-MS、~1H-NMR、~(13)C-NMR、DEPT等波谱方法进行结构鉴定。运用高效液相色谱仪对玉叶金花中绿原酸的含量测定,并通过一测多评的方法,以玉叶金花中绿原酸为内标,对异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C三种成分的含量进行测定,通过同时利用外标法和一测多评测定不同产地中4种有机酸类化合物成分的含量,比较两种方法的测定结果是否存在差异。通过用多脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW246.7)炎症,利用噻唑蓝(MTT)试剂法对一定浓度范围内绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C,4种化合物的细胞毒性进行测定,并测定NO、IL-6、TNF-α的释放量,从而探究4种成分的抗炎活性。结果:从玉叶金花醇提物的乙酸乙酯部位和乙醇部位提取分离得到15个化合物,鉴定了其中的14个化合物的结构,分别是山栀子苷甲酯(shanzhiside methyl ester)(1);schimoside(2),mussaendiside L(3),隐绿原酸甲酯(4-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(4),绿原酸甲酯(3-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(5),玉叶金花苷酸甲酯(mussaenoside)(6),异绿原酸B甲酯(3,4-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(7),异绿原酸A甲酯(3,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(8),异绿原酸C甲酯(4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(9),quinovic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-L-rhamnopyranosyl ester(10),绿原酸(3-dicaffeoylquinic acid)(11),异绿原酸B(3,4-dicaffeoylquinic acid)(12),异绿原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)(13),异绿原酸C(4,5-dicaffeoylquinic acid)(14)。玉叶金花药材中绿原酸在0.2547~2.5475μg(R~2=0.9999)具有良好的线性关系。以绿原酸作为内参物,分别计算与异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的相对校正因子,实现一测多评。结果显示一测多评和外标法测定结果无明显差异。实验所测得的相对校正因子重复性良好。测定绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C分别为0.1936~0.9680μg、0.2016-1.0080μg、0.1956-0.9780μg、0.2016-1.0080μg进样量范围内具有良好的线性关系,R~2均大于0.999。含量测定中方法学考察结果均符合相关要求。在20~100μM的给药浓度范围内,4种成分的细胞增殖与空白组相比无统计学意义,且抗炎活性存在一定的差异,其中绿原酸的抗炎效果不明显,异绿原酸B的抗炎效果最好,绿原酸在给药达到80μM时才具有一定的抗炎效果,而异绿原酸B在20μM时已具有一定的抗炎活性,当给药浓度达到80μM时已经能够完全抑制炎症,在探究除绿原酸外其他三种化合的抗炎活性时,给药浓度为20~60μM时,对IL-6的释放有一定抑制效果,但是对TNF-α的释放没有抑制效果。结论:其中化合物2、4、5、7-14为首次从该植物中分离得到,玉叶金花中有机酸类成分含量测定方法简单易行,重复性良好,一测多评方法应用于玉叶金花中有机酸类成分的含量测定成本低且具有良好的重复性,为玉叶金花的质量评价提供科学参考。玉叶金花中咖啡酰奎宁酸类化合物具有一定的抗炎活性。
【学位授予单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R284.1
【图文】：

玉叶金花,对照品,样品

绿原酸对照品玉叶金花样品图 15：玉叶金花样品及对照品 HPLC2.2.2 玉叶金花中绿原酸提取方法的考察（1）提取方法取玉叶金花茎粗粉（过 40 目筛）1.0g，精密称定，精密量取甲醇，称重，分别用回流提取和超声提取两种方法提取，提取 30mi却后补足失重，微孔滤膜滤过，按 2.1 项下色谱条件测定进行分析。原酸的含量作为参考依据（n=2）时，结果为两种提取方法测得绿原含量分别为，回流提取为 0.504 mg/g，超声提取为 0.494 mg/g。通过表明，两种提取方法对玉叶金花粉中绿原酸的提取无明显差异，鉴

高效液相色谱,高效液相色谱,玉叶金花

精密称取玉叶金花粗粉（过 40 目筛）1.0 g，精密加入 50%甲醇 50 mL，称定，超声（300 W，45 kHz）处理 30 min，放冷，补足失重，微孔滤膜滤过，即为所得。③ 色谱条件色谱柱： SHISEIDO C18 MGⅡ（5μm，4.6 mml.D.×250 mm）；柱温 30 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈（A）：0.4%磷酸（B），梯度洗脱（0-20 min，10%A-18%A；20-50 min，18%B-20%B；50-55 min，20%B-34%B）；检测波长：325 nm[20]。在此色谱条件下，玉叶金花中 4种有机酸具有良好的分离效果，其中绿原酸理论塔板数为 41249，分离度R 为 2.0。色谱图见图 16。

柱状图,细胞毒性,柱状图,异绿原酸

图 17 MTT 测定细胞毒性柱状图注：a 代表绿原酸；b 代表异绿原酸 A；c 代表异绿原酸 B；d 代表异绿原酸 C3.3.3 Griess 试剂测定 NO 的释放表 47 和图 18 表示为 4 种化合物不同给药浓度下的 NO 释放量及抑制效果。结果显示，4 种化合物不同给药浓度和诱导组与空白组相比，NO 释放量显著升高，给药组与诱导组相比，随着药物浓度的增加，4 种化合物降低 NO 的释放量作用越来越显著。异绿原酸 B 在浓度为 80μM时表现出与空白组无差异，表明给药浓度能够达到完全抑制 LPS 的诱导作用。

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