24种中草药水提物抗五步蛇毒活性研究与从石柑子水提物中分离纯化和鉴定抗五步蛇毒活性的有效成分研究

发布时间：2020-07-21 19:41

【摘要】：毒蛇咬伤(俗称蛇伤)被WHO规定为一种被忽视的热带疾病,其多发于热带或亚热带的贫困山村。蛇伤中毒常常给蛇伤患者带来身体损害、经济负担和心理恐慌后遗症等。蛇伤急救常用的治疗方法是采用从被蛇毒免疫的动物(如马)制备的抗蛇毒血清来治疗蛇伤病人。但是,在部分地区(主要是不发达或发展中地区)因多种因素限制仍然采用草药治疗蛇伤。尤其在我国,采用中草药治疗蛇伤获得了比较满意的效果,为蛇伤病人解除了疾苦。可是,采用中草药治疗蛇伤的科学实验证据还不充分,为此,本研究采用我国蛇伤医生常用来治疗蛇伤病人的24味中草药。通过抗蛇毒活性实验来初步揭示这些中草药的有效性。使用超声波提取方式,分别从24味中草药中获得各自的水提物,再用琼脂糖平板法分别检测这24种中草药水提物对五步蛇毒中主要功能成分包括PLA_2、透明质酸酶和蛋白水解酶等的活性的抑制作用,实验结果表明,这24味中草药都有抗蛇毒活性作用,有的强,有的弱,唯有石柑子抗五步蛇毒活性的作用最强。为了进一步确认石柑子水提物的抗蛇毒活性作用,体外实验结果表明,石柑子水提物对五步蛇毒中的磷脂酶A_2(PLA_2)活性、透明质酸酶活性、蛋白水解酶活性、凝血活性均能完全抑制,且呈量效关系;活体动物(小白鼠)实验结果表明,石柑子水提物对五步蛇毒的出血活性和致死活性均具有显著抑制作用。为了鉴定出石柑子水提物中抗蛇毒活性的有效成分,我们采用大孔树脂层析,分别用25%、50%和75%乙醇洗脱,收集洗脱液,检测其抗蛇毒PLA_2和蛋白水解酶的活性作用,实验结果表明,采用75%乙醇洗脱出的洗脱液的抗蛇毒活性效果最强;再将该洗脱液进行HPLC分离纯化,获得三个分离峰即P_1、P_2和P_3,分别开展这三个峰抗蛇毒PLA_2和蛋白水解酶的活性作用检测,实验结果表明,P_2峰具有最好的抗蛇毒活性作用。进一步鉴定P_2峰中的有效物质,我们使用气质联用仪检测分析,初步实验结果表明,P_2峰的主要有效成分为邻苯三酚,其呈现抗五步蛇毒PLA_2和蛋白水解酶的活性作用非常明显。总之,本研究初步揭示了24味中草药具有一定的抗五步蛇毒活性,其中,石柑子抗五步蛇毒活性最强,并从石柑子中分离鉴定出有效成分之一为邻苯三酚,这些初步实验结果在某种程度上提供了我国蛇伤医生常用的24味中草药治疗蛇伤的科学实验证据,但是,还有很多有效成分需要进一步的鉴定研究,以及这些有效成分如何在分子水平与蛇毒中主要毒素成分之间发生相互作用也需要进一步研究。
【学位授予单位】：重庆师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285
【图文】：

五步蛇毒,透明圈,卵磷脂,量效关系

图 2.1 卵磷脂平板中五步蛇毒剂量与透明圈直径之间的量效关系图② 不同的中草药水提物对五步蛇毒中 PLA2活性的抑制效果实验取平均值做表，如表 2.1，以单独 5 μg/15 μL 五步蛇毒（蒸馏水溶解）所形 12mm 透明圈，为 5 μg 五步蛇毒 PLA2活性的参照，实验结果计算平均值，作表 2.1。在中草药水提物与五步蛇毒质量比为 200∶1 的情况下，大部分中透明圈直径在 10-12 mm，对五步蛇毒中 PLA2的活性抑制效果微弱，或几乎抑制效果。小叶三点金、红背丝绸、东风菜和岩蒿透明圈在 7-10 mm，对五步中 PLA2的活性抑制效果在 30%左右，仅有蛇莓和石柑子在与五步蛇毒质量比00∶1 的情况下，没有形成透明圈，完全抑制了步蛇毒中 PLA2的活性。

五步蛇毒,透明圈,量效关系,剂量

图 2.2 酪蛋白平板中五步蛇毒剂量与透明圈直径之间的量效关系图② 不同的中草药水提物对五步蛇毒中蛋白水解酶活性的抑制效果实验取平均值做表，如表 2.2，以单独 40 μg/15 μL 五步蛇毒（蒸馏水溶解）所的 15mm 透明圈，为 40 μg 五步蛇毒 PLA2活性的参照，实验结果计算平均值制作表 2.1。在中草药水提物与五步蛇毒质量比为 5∶1 的情况下，大部分中透明圈直径在 12 mm 以上，对五步蛇毒中蛋白水解酶的活性抑制效果不足 20芷、蛇莓、小叶三点金和万年青对蛋白水解酶的抑制效果在 20-50%，鱼腥草风菜对五步蛇毒中蛋白水解酶的活性抑制效果在 50%左右，仅有石柑子在与蛇毒质量比为 5∶1 的情况下，没有形成透明圈，完全抑制了步蛇毒中蛋白水的活性。

五步蛇毒,透明圈,透明质酸钠,量效关系

图 2.3 透明质酸钠平板中五步蛇毒剂量与透明圈直径之间的量效关系图②不同的中草药水提物对五步蛇毒中透明质酸酶活性的抑制效果实验取平均值做表，如表 2.3，以单独 40 μg/15 μL 五步蛇毒（蒸馏水溶解）所的 15 mm 透明圈，为 5 μg 五步蛇毒透明质酸酶活性的参照，实验结果计算平，并制作表 2.3。在中草药水提物与五步蛇毒质量比为 5∶1 的情况下，少部草药透明圈直径在 10-12 mm，对五步蛇毒中透明质酸酶的活性具有一定抑制，大部分中草药透明圈在 4-10 mm，对五步蛇毒中 PLA2的活性具有较好的抑果，而柚子叶、鱼腥草、萝呮、东风菜、岩蒿和石柑子在与五步蛇毒质量比00∶1 的情况下，透明圈直径在 0-4 mm，对步蛇毒中透明质酸酶的活性抑制效 75%以上，具有相当好的抑制效果。

【参考文献】