全外显子组测序探寻胆固醇结石致病基因及中药单体预防胆固醇结石的实验研究

发布时间：2020-07-22 18:23

【摘要】：胆固醇结石是一种多因素共同作用的复杂代谢性疾病;全外显子组测序(Whole exome sequence,WES)作为新一代测序技术,是利用序列捕获技术将全外显子区域的DNA捕捉并富集,然后进行高通量测序的基因组分析技术。WES的目标区域是包含人类80%基因致病性疾病的蛋白质编码区域,对常见和罕见的变异高度灵敏,能够发现外显子区域绝大部分疾病相关变异。全外显子测序技术为探寻胆固醇结石可疑致病基因提供了契机。本研究拟以具有遗传背景的胆固醇结石患者为对象,采用WES技术,经过和数据库、过滤器比对结合生物信息学分析筛选出胆固醇结石可疑致病变异基因;通过核心小家系的筛选、Sanger验证和保守性分析对位点进行验证;通过动物模型初步验证可疑致病基因,为胆固醇结石的遗传学发病机制研究提供新的线索;柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSD),是从中药柴胡提取的中药单体;具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂以及保肝的等药理学作用;动物实验中首次将SSD用于胆固醇结石疾病领域,探讨SSD预防胆固醇结石的有效性及可能的保护性机制,为治疗胆固醇结石的新药开发和早期预防提供理论指导。第一部分:全外显子组测序探寻胆固醇结石致病基因及功能预测目的:本研究以具有遗传背景的胆囊胆固醇结石患者为研究对象,采用全外显子组测序探寻与胆固醇结石发病相关的可疑致病变异基因。方法:以21例家族胆固醇结石患者和5例家系内健康成员为研究对象,收集病例资料。采集外周静脉血5ml,提取基因组DNA,进行WES,经历严格的质量控制系统得到产出数据。采用两种筛选策略进行数据分析:(1)基于先验的脂质代谢相关基因及相关致病性变异,结合文献检索对数据进行比对和深入挖掘,得到胆固醇结石的可疑致病突变基因。(2)基于家系和所有患病样本的“Overlap”法,通过次要等位基因频率(Minor allele frequency,MAF)过滤器和在线软件SIFT、Mutation Assessor以及Poly Phen2对突变位点进行功能预测;同时对变异基因进行生物信息学分析包括GO(Gene ontology)基因本体功能和《京都基因与基因组百科全书》(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。将基因列表提交到交互基因检索工具(STRING)数据库,得到基因互作网络;使用Cytoscape version 3.4.0软件将基因的相互作用网络图可视化,应用插入式分子复合体检测(MCODE)技术筛选出基因相互作用网络模块;结合以上生物信息学分析对得到的突变基因进行文献检索查重,最后得到可疑致病变异基因。结果:基于先验的深入挖掘认为基因LRP2、LRP5、PLTP、OSBPL10、MUC5B、ABCA1、ABCB11和TGR5可能在胆固醇结石的发病中占据重要地位;基于“Overlap”筛选原则和生物信息学分析得到PHLPP2、NOTCH1、INTS1、SMARCA4和HUWE1以及泛素介导的蛋白水解途径和蛋白质消化吸收信号通路可能在胆固醇结石疾病的发生发展中发挥作用。结论:通过WES得到庞大数目的变异基因,结合筛选策略和生物信息学分析最终定位13个可以致病变异基因(基于先验的LRP2、LRP5、PLTP、OSBPL10、MUC5B、ABCA1、ABCB11和TGR5;基于“Overlap”筛选的PHLPP2、NOTCH1、INTS1、SMARCA4和HUWE1)以及泛素介导的蛋白水解途径和蛋白质消化吸收信号通路,这些基因突变和信号通路可能在胆固醇结石的形成中发挥作用。第二部分:一个胆固醇结石家系的全外显子组测序及致病基因的定位研究目的:探索一个胆固醇结石家系的可疑致病基因,比对第一章节的致病变异,验证结果的准确性。方法:首先通过收集病史资料和腹部超声对胆固醇结石的家系进行胆结石筛查,并留取6名成员的外周静脉血提基因组DNA,进行WES,通过质控系统输出数据;比对千人计划数据库、db SNP141和EAS数据库对测序数据进行变异筛查,排除数据库中的已知变异保留患者共有并正常人没有的突变;结合Mutation Assessor、SIFT以及Poly Phen2对致病突变进行预测,选出可能性较大的致病突变基因;运用聚合酶链反应扩增和Sanger法将候选致病基因位点(INTS1和SOCS6)在家系内进行共分离验证,并在Pub Med和Google scholar中检索、查重以明确是否为新发变异。结果:在家族性胆石病家系中发现INTS1基因变异(p.Arg1522His/c.4565GA)与胆固醇结石疾病发生共分离。该基因变异是一个新发突变。结论:本家系中发现并验证了基因INTS1上新发的致病突变p.R1522H。WES可以快速准确的鉴定家族性胆固醇结石疾病的致病基因。第三部分:柴胡皂苷D预防胆固醇结石的实验研究目的:通过建立动物胆固醇结石模型,对先验挖掘得到的ABCA1、ABCB11和TGR5基因进行PCR验证;同时观察柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSD)对饮食诱导的C57BL/6鼠胆固醇结石形成的影响,检测ABCA1、ABCB11和TGR5的转录水平变化、检测胆汁成分的变化并进一步探究SSD对LKB1/AMPK信号通路的影响。方法:在动物实验中,采用高脂高胆固醇饲养法构建C57BL/6胆固醇结石模型。8-10周,雄性C57BL/6小鼠40只,体重18-20g,适应性饲养两周,采用随机数字法分成四组(n=10),正常对照组(N-CON组):常规饲料喂养;模型组(LITH组):高脂高胆固醇饲料喂养;熊去氧胆酸胶囊组(UDCA组):高脂高胆固醇饲料喂养,同时熊去氧胆酸胶囊灌胃处理;柴胡皂苷D组(SSD组):高脂高胆固醇饲料喂养,同时SSD灌胃处理;实验周期为八周,实验期间观察记录动物一般情况和体重变化。八周后解剖观察各组动物成石情况,记录结石率;留取结石,采用红外光谱观察溴化钾压片法对结石进行定性分析;留取胆汁,对各组胆汁脂质成份胆固醇、胆汁酸和磷脂进行检测并计算胆固醇饱和指数(Cholesterol Saturation Index;CSI);肝脏组织进行病理学HE染色对各组肝细胞损伤和脂肪浸润情况进行分析;肝脏组织提取RNA,采用实时荧光定量RT-PCR检测各组ABCA1、ABCB11和TGR5基因m RNA相对表达量;提取肝脏组织总蛋白,Western blot方法检测肝细胞AMPK及上游蛋白LKB1蛋白的活性水平。结果:第八周LITH组体重明显重于N-CON组,有统计学差异(P0.05),LITH组的结石率为100%,且胆结石成份鉴定为胆固醇结石;UDCA组和SSD组的成石率分别为20%、30%,与LITH组相比明显降低,差异有统计学意义(P0.05);胆汁胆固醇和磷脂在LITH组较N-CON组明显升高(P0.05),胆汁酸在LITH组较N-CON组明显下降(P0.05);治疗后,UDCA组和SSD组胆固醇和磷脂含量较LITH组,明显下降(P0.05);胆汁酸浓度在UDCA组和SSD组较LITH组有所升高,差异有统计学意义(P0.05);LITH组CSI大于1,表明胆固醇过饱和胆汁形成,UDCA组和SSD组CSI均小于1,表明SSD和UDCA都能够缓解过饱和胆汁的生成;苏木素-伊红染色(Hematoxylin Eosin;HE)N-CON组未见明显异常,呈现正常肝组织状态,LITH组视野可见大量脂肪空泡,脂肪空泡充满肝细胞胞质可将胞核被挤压到边缘,胞核疏松核质比例改变明显,可见部分可见核胀大、核碎裂甚至双核现象,肝细胞损伤严重;UDCA组和SSD组肝细胞损伤情况较LITH组好转,病理表现介于N-CON组和LITH组之间。RT-PCR检测结果显示ABCA1基因m RNA相对表达水平在N-CON组、LITH组和SSD组,未见明显没有差异(P0.05);LITH组ABCB11m RNA较N-CON组表达明显下降,TGR5m RNA表达在LITH组较N-CON组明显升高;SSD组ABCB11和TGR5 m RNA相对表达量较LITH组明显升高(P0.05);Western blot结果表明SSD能够明显增加LKB1和AMPK的磷酸化水平。结论:与正常组相比,LITH组ABCA1m RNA水平未见明显改变,ABCB11m RNA水平明显下降以及TGR5m RNA明显升高;SSD能够改善胆汁的脂质成份,缓解胆固醇过饱和胆汁生成。SSD通过激活LKB1-AMPK信号通路,从而起到预防胆固醇结石形成的作用;其中ABCB11和TGR5可能是效应靶点。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

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天津医科大学博士学位论文显子组捕获，Agilent 公司的全外显子捕获试剂盒（Agilent ll Exon v5 kit;50M ）捕获可达 50Mb。Illumina Hiseq 2000 作.1 基因组 DNA 文库建立 Agilent v5（50M）捕获平台进行全外显子组捕获，采用美国对基因组 DNA 样本制备试剂盒，建立基因组 DNA 文库。DN图 1.1。

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图 1.2 全外显子组测序信息分析流程图1.1.4.7.3 数据过滤器为了确保测序数据的质量、去除干扰测序数据的异质性噪音，首先对测序数据进行过滤。过滤方法如下：(1) 首先过滤除掉 reads 的接头序列；(2) 当单端测序结果 reads 内含有低质量碱基数目超过这条 reads 的一半时，应该删除这一组 reads；(3) 当单端测序结果 reads 内含有的 N 碱基数目超过这条 reads 的十分之一时，需要删除这一组 reads；经过过滤器后，得到"Clean data"，并且对测序数据进行统计分析，内容包括测序数目、数据产量和质量值分布等。1.1.4.7.4 原始数据比对Burrows-Wheeler Aligner 数据比对软件（BWA V0.7.15)，采用 BWA-MEM的比对方法将 cleanreads 比对到人参考基因组上(GRCh37/HG19)。分别对每一个lane 的测序数据比对，并且在比对的结果中添加 read group ID。使用 Picard-

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天津医科大学博士学位论文C3 296.2 50 14.81 合格，轻微降解H2 45.4 45 2.043 合格，轻微降解H1 92.8 45 4.176 合格，轻微降解H3 87.5 45 3.9375 合格，轻微降解G3 216.7 45 9.7515 合格，轻微降解G2 337.5 45 15.1875 合格，轻微降解G1 174.9 45 7.8705 合格，轻微降解F1 290 45 13.05 合格，轻微降解F4 223.3 45 10.0485 合格，轻微降解E2 210.2 45 9.459 合格，轻微降解E1 207.9 45 9.355 合格，轻微降解

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