不同配比丹参—檀香“药对”抗心肌缺血再灌注损伤的功效比较及心肌细胞保护机制研究

发布时间：2020-07-23 07:45

【摘要】：目的:本课题研究的目的是为了从不同配比的丹参-檀香药对中筛选出抗心肌缺血再灌注损伤疗效最好的组合,并对其作用机制进行研究,为指导中医临床用药和现代中药新药开发提供理论依据。方法:1.以提取物得率为指标,利用单因素实验考察和响应曲面优化分别对丹参和檀香药材的提取方法、药材粉碎粒度、提取溶剂种类、提取溶剂浓度、料液比进行筛选和优化,并建立最优的丹参和檀香药材提取方案。2.采用手术法造大鼠左前降支结扎的心肌缺血再灌注模型,取70只大鼠,分为7组,每组10只,雌雄各半,分别代表假手术组、模型组、阳性对照组、给药组1:丹参高剂量+檀香高剂量组(DGTG)、给药组2:丹参高剂量+檀香低剂量组(DGTD)、给药组3:丹参低剂量+檀香高剂量组(DDTG)、给药组4:丹参低剂量+檀香低剂量组(DDTD),分别测定各组的心肌梗死面积,观察HE染色的心肌组织病理变化,检测血清中CK、LDH和心脏组织中SOD、GSH-Px的活力以及心脏组织中MDA的含量,并利用RT-PCR技术对心肌组织中Bcl-2和Bax基因的相对表达量进行了测定,通过以上指标来确定丹参-檀香药对的最佳组合,并对其体内协同发挥抗心肌缺血再灌注损伤作用的机理进行初探。3.建立H9C2心肌细胞的缺氧缺糖/再灌注模型(OGD/R),分别提取大鼠给药丹参提取物、檀香提取物和丹参-檀香混合提取物10天后的含药血清,利用MTT法分别考察以上三组含药血清的细胞毒性和对H9C2细胞的保护作用,进而通过结晶紫染色观察不同给药组的细胞形态,通过Hochest 33258和EB/AO染色考察不同给药组对细胞凋亡的影响,通过JC-1染色考察不同给药组对线粒体损伤的影响,为后续蛋白组学的研究提供趋势和线索。4.运用iTRAQ定量蛋白组学方法对空白对照组(DZ)、OGD/R模型组(MX)、丹参含药血清组(FA1)、檀香含药血清组(FA2)和丹参-檀香混合含药血清组(FA3)的心肌细胞进行蛋白组学研究,利用UniProt-GOA数据库对不同实验组之间差异表达蛋白(P-value0.01,FC≥1.5)的功能进行生物过程、细胞定位和分子功能的GO注释分析,利用在线工具KAAS对差异表达蛋白(P-value0.01,FC≥1.5)的功能进行注释,并使用KEGG mapper绘制注释蛋白的信号通路。通过分析关键差异蛋白的功能和信号通路信息,构建丹参-檀香协同发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用网络;然后,利用Western blot技术对网络中关键节点的蛋白表达和磷酸化情况进行验证,最终确定丹参-檀香配伍使用的作用机理。结果:1.丹参和檀香的最佳提取工艺分别为:丹参提取物最佳工艺(药材粉碎粒度100目,乙醇浓度约为54%,料液比1:25)和檀香提取物最佳工艺(药材粉碎粒度160目,乙醇浓度约为81%,料液比1:23)。2.心肌梗死面积测定结果显示,与模型组相比,阳性对照组和给药组1,2,和3均能显著降低大鼠心肌梗死面积(P0.01),给药组4虽然也能降低大鼠的心肌梗死面积(P0.05),但其作用效果明显劣于其他三组;HE染色结果表明,丹参对心肌组织损伤的保护贡献度较高,所有丹参高剂量组(给药组1和2)的治疗效果均好于丹参低剂量组(给药组3和4);而檀香对心肌损伤的保护作用也呈现一定的剂量依赖性,高剂量组治疗效果优于低剂量组。血清心肌酶测定结果表明,给药组和阳性对照组均能显著降低血清中CK和LDH的含量(P0.01),给药组的作用效果与丹参和檀香提取物的加入量呈现一定的剂量依赖性,总体来讲,给药组1的效果最好,其次为给药组2、给药组3和给药组4;心脏组织氧化应激损伤指标测定结果表明,阳性对照组和各给药组的SOD含量均明显升高(P0.01,P0.05);阳性对照组、给药组1、2、3的GSH-Px的含量明显升高(P0.01,P0.05),MDA的含量显著降低(P0.01);而给药组4仅对SOD的活力有显著影响(P0.05),但对GSH-Px和MDA含量只有升高和降低的趋势,与模型组相比,没有显著性差异。RT-PCR实验结果表明,给药组1、2、3和阳性对照组均能显著升高Bcl-2的相对表达量(P0.01,P0.05),所有给药组和阳性对照组均能显著降低Bax的相对表达量(P0.01,P0.05),说明以上实验组均能不同程度的抑制心肌细胞凋亡,起到一定的保护心肌细胞作用;相对而言,给药组1和给药组2对Bcl-2和Bax的表达调控均极为显著,是所有给药组中保护心肌细胞作用效果最好的两组。3.MTT实验结果表明,丹参-檀香混合组(DTE)在5%浓度剂量时的保护作用最为显著(P0.01),其次分别为丹参提取物组(DE)5%浓度剂量(P0.05)和檀香提取物组(TE)5%浓度剂量(P0.05);通过结晶紫染色观察细胞形态进一步证实了丹参-檀香合用要优于拆方之后的单独使用效果;Hochest 33258染色结果表明,DTE、DE和TE均能显著降低凋亡细胞的数量(P0.01),其中作用效果强弱顺序为DTEDETE;EB/AO染色表明,DTE的凋亡细胞比例明显下降(P0.01),染色质形态也趋于正常,具有较好的心肌细胞保护作用;DE和TE与模型组相比,凋亡细胞的比例也有明显的下降(P0.01),但TE的早期凋亡细胞(绿色斑点)的比例要明显高于DE,因此其心肌细胞凋亡抑制作用要相对较弱;JC-1染色结果表明,DTE、DE和TE均能显著降低绿色荧光的比例(P0.01),其中DTE作用效果要优于其他两组,而DE和TE的作用效果相仿。4.GO功能注释结果表明,经过丹参含药血清预处理后,心肌细胞外部空间和环境相关蛋白的表达、细胞生长调节、脂代谢、胆固醇代谢、甘油三酯代谢和细胞内各种微粒的清除能力等均有不同程度的影响;檀香含药血清除了对细胞外部空间和环境相关蛋白的表达影响,对ATP合成、氧结合与氧运载能力等方面也有不同程度的改善;将丹参与檀香合用之后,对细胞的外部空间环境响应、紧急情况应激反应、缺氧应激反应、氧化应激反应、机械刺激应激反应、线粒体ATP合成、质子转运、脂质代谢和转运、蛋白合成、钙调蛋白结合能力等均有不同程度的影响,说明将二者结合使用,会产生更为广泛的生物活性。KEGG功能注释及信号通路分析结果表明,给药丹参含药血清之后,胶原粘附蛋白高表达,激活下游PI3K-Akt信号通路,以产生抑制细胞凋亡的效果,同时溶酶体表达下调,也佐证了损伤细胞器的减少,证明产生了一定的治疗效果;檀香提取物含药血清与丹参提取物含药血清的作用通路相似,均与胶原粘附过程和PI3K/Akt通路相关,同时,檀香提取物含药血清对细胞粘附因子(CAMs)也有一定的影响,该类成分可以激活相应的细胞凋亡通路,也经常作为抗心肌缺血再灌注损伤的靶点出现;将丹参-檀香合用之后,其作用靶点涉及到MAPK、PI3K/Akt和VEGF等经典的细胞凋亡通路,还涉及到氧化磷酸化反应和脂肪酸代谢等与线粒体相关的作用通路,推测二者合用之后,在抑制细胞凋亡、防止线粒体氧化损伤和增强能量代谢等方面产生了积极的影响。Western blot实验结果表明,丹参-檀香含药血清高剂量组(5%)可以显著上调(P0.01)细胞存活和抑制凋亡蛋白Vtn、PI3K和XIAP的表达,显著上调(P0.01)Akt1蛋白的磷酸化水平,并显著下调(P0.01)促凋亡蛋白NF-κB、p38和MAPKAPK2的磷酸化水平,从而协同发挥保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤的效果。结论:丹参-檀香药对的最优组合为丹参15g/天+檀香6g/天,在体内实验中可以协同发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用,其作用机理可能与抑制心肌细胞凋亡和调节心脏组织氧化应激环境有关。在OGD/R细胞模型实验中,丹参-檀香配伍使用具有极好心肌细胞保护作用,其作用效果要优于丹参提取物单独给药和檀香提取物单独给药;丹参-檀香配伍和丹参单独使用主要是通过抑制细胞凋亡来降低死亡细胞数的,而檀香单独使用仅仅能够减少晚期凋亡的细胞数,对于早期凋亡的抑制效果并不明显。同时,丹参-檀香提取物可以有效调节线粒体膜电位的变化,说明其抗心肌细胞OGD/R损伤的机理也与防护线粒体损伤有关。通过蛋白组学研究,进一步明确了丹参-檀香配伍使用可以抑制细胞凋亡、减轻线粒体损伤、降低ATP消耗、缓解钙超载的状态,以达到抗心肌缺血再灌注损伤的效果,其作用机理的核心是通过Vtn/PI3K/Akt/NF-κB途径增加细胞增殖和存活能力,同时通过p38/MAPK途径抑制细胞凋亡而实现的。
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

丹参提取物,交互影响

乙醇浓度60%，料液比1:20时，丹参提取物得率最高，约为27.87%。接下来，利用Design Expert软件对得出的数据进行分析和优化，阐明了三个因素之间的交互作用关系，如图1-3所示：图1 粉碎粒度和乙醇浓度对丹参提取物得率的交互影响图1表明，在考察的参数范围内，丹参提取物得率与丹参药材粉碎的粒度呈明显的正相关，在固定乙醇溶液浓度的情况下，丹参提取物得率随药材粉碎粒度提高而升高；在固定药材粉碎粒度的情况下，丹参提取物得率随着乙醇浓度升高呈现先升高后降低的结果。

丹参提取物,交互影响,提取溶剂

长春中医药大学 2019 届博士学位论文33图2 料液比和粉碎粒度对丹参提取物得率的交互影响图2表明，在考察的参数范围内，丹参提取物得率与提取溶剂的加入倍数呈明显的正相关，在固定药材粉碎粒度的情况下，丹参提取物得率随提取溶剂的加入倍数提高而升高；然而，在这两个因素的交互作用中，粉碎粒度对丹参提取物得率的影响并不显著。图3 料液比和乙醇浓度对丹参提取物得率的交互影响图3表明，在考察的参数范围内，丹参提取物得率与提取溶剂的加入倍数呈明显的正相关，在固定乙醇浓度的情况下，丹参提取物得率随提取溶剂的加入倍数提高而升高；同样，在这两个因素的交互作用中，乙醇浓度对丹参提取物得率的影响并不显著。综上所述，三个考察的因素中，料液比是影响最为显著的一个因素，其次为药材粉碎粒度和乙醇浓度

丹参提取物,交互影响

而升高；然而，在这两个因素的交互作用中，粉碎粒度对丹参提取物得率的影响并不显著。图3 料液比和乙醇浓度对丹参提取物得率的交互影响图3表明，在考察的参数范围内，丹参提取物得率与提取溶剂的加入倍数呈明显的正相关，在固定乙醇浓度的情况下，丹参提取物得率随提取溶剂的加入倍数提高而升高；同样，在这两个因素的交互作用中，乙醇浓度对丹参提取物得率的影响并不显著。综上所述，三个考察的因素中，料液比是影响最为显著的一个因素，其次为药材粉碎粒度和乙醇浓度，该观察结果也得到了软件理论计算的支持（见图4）。

【参考文献】