糖肾方改善肾间质纤维化的作用机制研究

发布时间：2020-07-23 07:58

【摘要】：肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)表现为过量的细胞外基质沉积,是许多慢性肾脏疾病的主要病理基础,造成肾脏功能的不可逆损伤,同时在糖尿病肾病中肾间质纤维化促进病情进展,因此抑制RIF是保护肾脏的有效治疗策略。中医药防治肾间质纤维化有其独特的优势。糖肾方(tang shen fomula,TSF)是本课题组继承名老中医经验基础上,结合现代研究成果和临床实践,以益气柔肝、活血通络立法,组方面来。它是由黄芪,生地黄、山茱萸、三七、卫矛、熟大黄、枳壳七味中药组成的复方制剂。多中心临床试验证明TSF可以较好的防治糖尿病肾病的作用,改善血肌酐,肾小球滤过率等。针对糖肾方大孔树脂富集、醇提以及水提的多种制备工艺,本研究利用经典的单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruct,UUO)小鼠动物模型对糖肾方颗粒的制备工艺进行评价,以确定糖肾方最优提取方法。确定糖肾方颗粒的制备工艺路线后,同时选用该工艺组作为糖肾方治疗组。同时进行糖肾方颗粒改善肾间质纤维化的作用机制研究。1.目的1.1利用单侧输尿管梗阻小鼠模型筛选糖肾方颗粒的最佳制备工艺。1.2探究糖肾方抑制小鼠单侧输尿管梗阻导致的肾间质纤维化的作用,以及作用机制。2.方法2.1根据大孔树脂富集、醇提、水提方法设计糖肾方制备工艺一,二,三。选用60只八周龄的雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组,模型组,糖肾方工艺路线一、二、三组以及阳性药福辛普利组。适应性喂养三天后,预给药一周后进行单侧输尿管梗阻手术,手术后一周处死小鼠。TSF组给予TSF药物(2.4g/kg/天),福辛普利组给予福辛普利(1.5g/kg/天),假手术组和模型住给予相同体积的蒸馏水。给药方式全部采用灌胃给药。2.2收集血液标本后检测血清中的肌酐,尿素氮,谷丙转氨酶和谷草转氨酶。根据MASSON染色半定量分析评估各组小鼠的肾间质纤维化程度。根据HE染色进行肾间质细胞浸润评分,评估肾小管间质损伤程度。提取小鼠肾组织中的总RNA后,逆转录得到模板cDNA,并通过实时PCR分析目的基因。提取小鼠肾脏的蛋白,并将提取的蛋白进行蛋白印迹分析。同时通过免疫组化分析目的蛋白的表达水平。2.3将实验数据用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)分析。分析结果表示为平均值±SD。当AP value of0.05时,被认为有统计学意义。3结果3.1确定糖肾方颗粒的制备工艺各工艺路线组均对UUO引起的小鼠肾病理损伤有一定的改善作用,均显著改善肾间质纤维化(P0.05),其中工艺路线一、三组作用更佳。工艺路线三组能显著改善小鼠UUO后的血肌酐和尿素氮水平,显著减少肾间质细胞浸润(P0.05)。糖肾方颗粒的制备工艺路线三组为水提工艺。3.2TSF改善了UUO小鼠的肝肾功能进行UUO手术后七天,小鼠肾功能会出现损伤,TSF治疗能显著改善UUO诱导的肾功能,同时改善肝脏功能。与假手术组相比,模型组肌酐,尿素氮,谷丙转氨酶,谷草转氨酶水平显著增加,TSF治疗组的血清水平下降。3.3 TSF减弱了UUO诱导的肾间质纤维化UUO模型是一种典型的肾间质纤维化模型。模型组αα-平滑肌肌动蛋白,纤连蛋白,波形蛋白,一型胶原的蛋白和mRNA表达显著增加,而E-钙黏素的蛋白和mRNA表达下降。然而,与模型组相比,在TSF组中观察到αα-平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白,波形蛋白,一型胶原mRNA和蛋白表达的下调,同时E-钙粘蛋白mRNA和蛋白水平的上调。两组之间有显著差异(图2,P0.05)。3.4 TSF改善RIF的作用与调控TGF-β/smads信号通路有关TGF-β/Smads信号传导通路在肾间质纤维化中起着重要的作用。在UUO手术七天的小鼠肾脏中,免疫组化结果TGF-β1的表达显著高于假手术组,TSF治疗后TGF-β1的表达受到显著抑制。Western blotting and qPCR的结果是一致的。同时,Western blotting的结果表明,UUO组的磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)水平显著高于假手术组,TSF治疗同样也能抑制p-Smad2/3的表达。4.结论4.1确定糖肾方颗粒的制备工艺路线为水提工艺。4.2TSF治疗可以抑制单侧输尿管梗阻导致的小鼠肾间质的纤维化,其作用可能是与抑制TGF-β/Smads信号通路的传导有关,明显抑制了肾间质纤维化的标志蛋白的表达。证明了糖肾方颗粒有较好的抗肾间质纤维化作用。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

以显著降低肌酐和尿素氮水平，工艺一组显著降低肌酐水平，工艺二组显著性降低逡逑尿素氮水平；阳性药福辛普利的肌酐和尿素氮水平、工艺一组的尿素氮水平以及逡逑工艺二组的肌酐水平无统计学差异（图１邋）。逡逑ｓｈａｍ逦ＵＵＯ逦ＴＳＦ－１逡逑ｍｍｍ逡逑ＴＳＦ－２逦ＴＳＦ－３逦Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ逡逑４３逡逑

图４邋ＴＳＦ备工艺组小鼠的肾小管间质细胞浸润评分逡逑注：数据以均数土标准误（Ｍｅａｎ邋士邋ＳＥＭ）表示。＃＃＃Ｐ邋＜０．００１，ＵＵ０组与ｓｈａｍ组相比较；逡逑＊Ｐ＜邋０．０５，邋ＴＳＦ－１邋组及邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ邋组与邋ＵＵ０邋组相比较；＊＊＊Ｐ＜邋０．００１，ＴＳＦ－３邋组及邋Ｆｏｓｉｎｏｐｒｉｌ邋组与逡逑ＵＵＯ组相比较．逡逑４５逡逑

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本文编号：2767078