补阳还五汤大鼠含药血清介导mTOR调控TGF-β诱导成纤维细胞自噬机制研究

发布时间：2020-07-23 10:38

【摘要】：肺纤维化(PF)作为多种原因引起的肺泡正常结构被损伤最终导致肺间质性纤维化病变的纤维异常增生性疾病~([1、2])。目前肺纤维化发病机制尚未明确,又无特殊有效的治疗方法,导致肺纤维化致残率、死亡率颇高,严重威胁人类健康。肺纤维化作为现代医学疑难杂症,明确其发病机制和防治策略对人类健康具有积极意义。诸多相关研究表明在肺纤维化形成过程中,自噬并未被激活,自噬不足、缺陷,PTEN、ULK1含量极低,肺纤维化形成加快。能否通过提高PTEN、ULK1含量,激活或诱导自噬来延迟肺纤维化?肺纤维化作为现代医学疑难杂症,我们补阳还五汤课题组在以往采用益气、活血、通络研究肺纤维化过程中,TGF-β1可能通过Smad和PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制自噬。我们在以往的研究中发现补阳还五汤能够在保外启动多条与肺纤维化有关的信号通路,例如TGF-β1/Smad、MAPKs、NF-kB等相关信号通路,而这些信号通路和细胞自噬存在相关联系~([1-4])。基于此,我们根据以往的研究基础,我们选择与细胞自噬密切相关的mTOR信号通路,通过该信号通路来研究细胞自噬,探寻细胞自噬和肺纤维化之间的关系,揭示补阳还五汤防治肺纤维化的机制。目的:本研究采用C57小鼠动物体内实验,结合人胚肺成纤维细胞(HFL1)、人胚肺细胞(MRC5),通过体内、体外细胞实验,来研究验证m TOR信号通路和肺纤维化的关系,探寻细胞自噬和肺纤维化之间的关系,揭示补阳还五汤防治肺纤维化的机制。方法:1、将144只SPF级健康雄性C57BL/6小鼠随机分为6组,NS组、BLM组、强的松组、补阳还五汤高、中、低剂量组,第7天、第14天和第28天随机抽取8只股动脉放血处死取肺组织作HE、Masson病理切片和免疫组化检测mTOR、。2、将HFL1、MRC5细胞分为六组:空白组、TGF-β1刺激组、20%空白血清组、补阳还五汤含药血清5%、10%、20%三个组,采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5细胞后,使用5%、10%、20%的补阳还五汤含药血清进行干预,24h后提取细胞培养液上清。通过ELISA法检测补阳还五汤含药血清在体外对细胞培养上清中α-SMA、p-S6等蛋白表达的影响。将HFL1、MRC5细胞分为六组:空白组、TGF-β1刺激组、20%空白血清组、补阳还五汤含药血清5%、10%、20%三个组,采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5细胞后,使用5%、10%、20%的补阳还五汤含药血清进行干预,分别在0、6、12、24、48、72h时提取细胞总蛋白。通过Western blot法检测补阳还五汤含药血清在在体外不同时间内对细胞总蛋白中PTEN、ULK1等蛋白表达的影响。结果:1、一般情况:空白组小鼠,精神抖擞,机警灵敏,体重增加,毛发光亮,饮食、排便正常。模型组小鼠,7天后精神不振,反应迟钝,体重下降。14天后精神萎靡,反应迟缓,体重下降明显,毛发失泽,饮食量少,小便较多,饲养笼内木屑被小便溺湿。28天精神发呆,站立不稳或行动困难,脱毛乱杂无光,体格瘦弱,饮食差,小便多,饲养笼内多处木屑被小便溺湿。补阳还五汤和强的松组小鼠,精神较好,反应敏捷,体重逐步增加,毛发光泽,饮食、排便基本正常。但比空白组稍差,比模型组好。2、病理形态学:小鼠肺组织HE染色显示,NS组7天肺结构基本完整,肺泡间隔未增厚,无明显炎症浸润,14天、28天基本正常,BLM组7天肺结改变,间隔水肿,肺泡壁增厚,充血、炎症浸润。第14天灶性区充血、水肿,间隔增宽,伴炎症浸润,肺泡壁纤维增生,肺泡萎缩。第28天肺泡炎减轻,肺泡破坏,间隔明显增宽、断裂,大量成纤维细胞,胶原沉积,纤维瘢痕出现。补阳还五汤各剂量组不同程度改善。强的松组与补阳还五汤各剂量组类似。肺泡受破坏,泡壁增厚,轻度水肿。小鼠肺组织Masson染色显示,NS组7天肺泡区未见明显浅蓝色胶原纤维,14天、28天未见扩大。BLM组7天间隔增宽,泡壁、间隔可见蓝色胶原纤维,14天血管壁、肺泡间隔可见蓝色胶原纤维,28天细支气管、纤维灶区大量蓝色胶原纤维,弥漫性分布。强的松组与补阳还五汤各剂量组7天间隔增宽,可见蓝色胶原纤维,14天蓝色扩大,加深。28天未见明显扩大、加深。比BLM组颜色浅、面积小。3、α-SMA、p-S6、ULK1、mTOR蛋白表达:与NS组比较,BLM组在7、14、28天的α-SMA含量均升高,而且随着时间推移,逐步升高,在28d达到峰值,*P0.05。与BLM组相比,强的松组和补阳还五汤组在7、14、28天的α-SMA含量均降低,~#P0.05。与强的松组相比,补阳还五汤高、中、低组在14、28天的α-SMA含量均降低,~△P0.05。与NS组比较,BLM组在7、14、28d的p-S6含量均升高,而且随着时间推移,逐步升高,在28d达到峰值,~*P0.05。与BLM组相比,强的松组在14、28d的p-S6含量降低,补阳还五汤组在14、28d的p-S6含量均降低,~#P0.01。与强的松组相比,补阳还五汤低组在7d、14d的p-S6含量降低,补阳还五汤中组在7d的含量均降低,补阳还五汤高组在28d的含量降低,~△P0.05。与NS组比较,BLM组在7、14、28d的ULK1含量均升高,~*P0.01。与BLM组相比,强的松组在7、14、28d的ULK1含量均升高,~#P0.05;补阳还五汤低、中组在28d的ULK1含量均升高,补阳还五汤高组在14、28d的ULK1含量均升高,~#P0.05。与强的松组相比,补阳还五汤中、低组在28d的ULK1含量升高,补阳还五汤高组在14d、28d的ULK1含量升高,~△P0.05。与NS组比较,BLM组mTOR含量均上升,~*P0.01。与BLM组相比,强的松组和补阳还五汤组在7、14、28d的mTOR含量均下降,~#P0.05。与强的松组相比,补阳还五汤高组在7、14d、28d的mTOR含量下降,~△P0.05。4、ELISA检测结果显示,采用不同浓度补阳还五汤含药血清干预HFL1、MRC5细胞0.5h后采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5细胞后,细胞内α-SMA、p-S6蛋白表达明显X椉

本文编号：2767215